memisahkan senyawa polar dan non polar, biasanya menggunakan fase balik fase gerak lebih polar daripada fase diam Johnson, 1991.
Pada fase balik, zat terlarut terelusi berdasarkan sifat kehidrofobannya. Ini berarti, semakin mudah zat larut dalam air, maka semakin cepat zat terlarut
tersebut terelusi dari kolom. Kromatografi dengan fase balik sangat populer digunakan daripada fase normal karena beberapa kelebihannya, yaitu puncak yang
terelusi dapat dipisahkan dengan mudah, puncak kecil dapat ditentukan dengan lebih teliti, dapat digunakan untuk memisahkan berbagai jenis campuran senyawa,
kemasan fase balik sering menghasilkan keselektifan yang baik untuk zat terlarut yang polar dan non polar Johnson, 1991.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik susunan fase gerak tetap selama elusi atau dengan cara bergradien susunan fase gerak berubah-ubah
selama elusi. Dalam penggunaan kromatografi cair kinerja tinggi secara baik dibutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional
seperti jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom, kecepatan aliran fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel Rohman, 2007.
2.7.1. Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Menurut Rohman 2007, instrumentasi kromatografi cair kinerja tinggi pada dasarnya terdiri atas beberapa komponen pokok yaitu:
i. Wadah fase gerak dan fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert. Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Universitas Sumatera Utara
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan fase gerak, polaritas fase diam, dan sifat molekul-molekul sampel.
ii. Pompa Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah
untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, konstan, dan bebas dari gangguan.
iii. Injektor tempat injeksi Sampel-sampel cair disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik. iv. Kolom
Kolom merupakan bagian yang sangat penting, sebab pemisahan komponen-komponen sampel terjadi di dalam kolom. Kemasan kolom terdiri dari
panjang kolom, garis tengah kolom, dan bentuk kolom lurus. Suatu kolom dikatakan bagus, apabila kolom tersusun dengan partikel-partikel dengan
distribusi ukuran sesempit mungkin berdiameter 1,5 sampai 7,5 μm. Kemasan
yang paling populer adalah kemasan yang mempunyai fase diam dengan lapisan oktadesilsilika atau oktadekilsilan ODS atau C
18
, karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
v. Detektor Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom analisis kualitatif dan menghitung kadarnya analisis kuantitatif.
Universitas Sumatera Utara
Detektor yang baik adalah detektor yang mempunyai respon terhadap zat terlarut yang cepat, sensitifitas yang tinggi, stabil dalam pengoperasiannya, dan tidak peka
terhadap gangguan yang rendah dan memberi respon untuk semua senyawa. vi. Komputer atau pengelolahan data Recorder
Alat pengelolahan data berupa komputer dihubungkan dengan detektor, sehingga alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor.
Lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis pengguna. Diagram blok sistem kromatografi cair
kinerja tinggi KCKT dapat dilihat pada Lampiran 1 halaman 32.
2.7.2. Faktor-faktor Yang Digunakan Untuk Evaluasi Kinerja Kolom
