2. Uji DPPH
Metode DPPH 1,1-difenil-2-pikril hidrazil merupakan metode yang paling sering dilakukan sebagai metode pengujian antioksidan pada ekstrak
tanaman Shivaprasad et al., 2005. Metode DPPH dapat digunakan baik pada pengujian kualitatif maupun kuantitatif Sarker, Latif, and Gray, 2005. Metode
DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, sensitif, dan reprodusibel untuk pengujian aktivitas antioksidan Savatovic et al., 2012.
Prinsip metode DPPH adalah reduksi larutan metanolik radikal bebas berwarna DPPH dengan cara penangkapan radikal bebas Shivaprasad et al.,
2005. DPPH merupakan senyawa radikal bebas stabil yang dapat berubah warna dari ungu Gambar 1a ke kuning Gambar 1b dengan adanya reduksi melalui
proses pemberian donor hidrogen atau elektron. Oleh karena itu, senyawa yang dapat mereduksi DPPH disebut sebagai antioksidan atau penangkap radikal bebas
Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, and Mohammad, 2009. Untuk pengujian secara kualitatif, pengujian antioksidan dengan metode
DPPH dilakukan secara kromatografi lapis tipis. Zat yang telah terelusi disemprot dengan reagen DPPH 0,2 dalam metanol Masoko and Eloff, 2007.
Berdasarkan berbagai jurnal acuan, panjang gelombang yang dapat digunakan sebagai working wavelength adalah 515-520 nm. Operating Time OT
yang optimal adalah 30 menit, namun dapat digunakan waktu yang lebih singkat 5 atau 10 menit pada jenis substrat yang berbeda. Sehingga pemilihan OT
tergantung pada hasil optimasi Molyneux, 2004.
a b
Gambar 1. a DPPH radikal, berwarna ungu; b DPPH non-radikal, berwarna kuning Molyneux, 2004.
Aktivitas antioksidan ditetapkan berdasarkan kadar efektif senyawa dalam menangkap radikal bebas yang dinyatakan dalam nilai “Effective
Concentration” EC
50
juga disebut “Inhibitory Concentration” IC
50
yang didefinisikan sebagai kadar penyebab hilangnya aktivitas DPPH sebanyak 50
Molyneux, 2004. Nilai itu dapat diketahui dengan memplotkan nilai serapan terhadap kadar ekstrak pada kurva atau dengan menghitung kemiringan kurva
menggunakan regresi linier Marxen et al., 2007. Nilai EC
50
berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidan Molyneux, 2004. Menurut Jun, Yu, Fong, Wan,
Yang, and Ho 2003, tingkat aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dapat digolongkan berdasarkan nilai IC
50
tabel I. Tabel I. Tingkat aktivitas dengan metode DPPH Jun et al., 2003.
Intensitas Sangat
aktif
Aktif Sedang
Lemah Tidak
aktif
Nilai IC
50
50
µgmL
50 – 100
µgmL
101 – 250
µgmL
250 – 500
µgmL
500 µgmL
D. Skrining Fitokimia dan Ekstraksi
Kategori