globulin; dan fibrinogen. Albumin adalah komponen utama dan mempunyai peranan utama mempertahankan tekanan osmotik darah. Beberapa zat yang tidak
larut atau hanya sedikit larut dalam air dapat ditransport oleh plasma karena mereka terikat dengan albumin atau dengan alfa dan beta globulin Junqueira,
1982.
2.5 Kromatografi 2.5.1 Teori Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh ahli botani rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman
denan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dala kolom gelas yang berisi kalsium karbonat CaCO
3
Rohman, 2007. Kromatografi didefenisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh
suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah
tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam absorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul,
atau kerapatan muatan ion. Teknik kromatografi umumnya membutuhkan zat terlarut terdistribusi di antara dua fase, satu diantaranya diam fase diam yang
lainnya bergerak fase gerak Ditjen POM, 1995.
2.5.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC dkembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal 1970-an. Saat
Universitas Sumatera Utara
ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel. Kegunaan umum KCKT
adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian impurities; analisis senyawa-senyawa tidak
mudah menguap non-volatile; penentuan molekul-molekul netral, ionik maupu zwitter ion. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein- protein dalam cairan fisiologis Rohman, 2007.
Berdasarkan mekanisme interaksi antara analit dengan fase diam, kromatografi cair dapat dibagi menjadi 4 metode, yakni: kromatografi fase normal
normal phase chromatography atau disebut juga kromatografi adsorpsi adsorption chromatography, kromatografi fase balik reversed-phase
chromatography, kromatografi penukar ion ion-exchange chromatography dan kromatografi eksklusi ukuran size-exclusion chromatography Riley, 1995.
Pada kromatografi fase normal, fase diam lebih polar daripada fase gerak. Dengan demikian analit yang polar lebih kuat terikat pada fase diam dan akan
dielusi dari kolom setelah analit yang kurang polar yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap fase gerak. Sedangkan pada kromatografi fase balik adalah situasi
dimana fase gerak lebih polar daripada fase diam. Pada kromatografi fase balik ini permukaan silika terikat kovalen dengan rantai panjang hidrokarbon yang
memberikan karakteristik permukaan yang sangat non polar. Dengan demikian analit yang lebih polar mempunyai afinitas yang lebih besar terhadap fase gerak
dibandingkan dengan fase diam dan akan dielusi lebih cepat daripada analit yang non polar Mellett, 2004.
Universitas Sumatera Utara
2.5.3
Proses Pemisahan dalam Kolom Kromatografi
Pemisahan dalam kromatografi cair disebabkan oleh distribusi kesetimbangan dari senyawa-senyawa yang berbeda antara partikel fase diam dan
larutan fase gerak Snyder dan Kirkland, 1979. Contohnya, campuran dua komponen dimasukkan ke dalam sistem kromatografi partikel
● dan ▲ Gambar 2a. Di mana komponen
▲ cenderung menetap di fase diam dan komponen
● lebih cenderung di dalam fase gerak Gambar 2b. Masuknya eluen fase gerak
yang baru ke dalam kolom akan menimbulkan kesetimbangan baru: molekul sampel dalam fase gerak diadsorpsi sebagian oleh permukaan fase diam
berdasarkan pada koefisien distribusinya, sedangkan molekul yang sebelumnya diadsorpsi akan muncul kembali di fase gerak Gambar 2c. Setelah proses ini
terjadi berulang kali, kedua komponen akan terpisah. Komponen ● yang lebih
suka dengan fase gerak akan berpindah lebih cepat daripada komponen ▲ yang
cenderung menetap di fase diam, sehingga komponen ● akan muncul terlebih
dahulu dalam kromatogram, kemudian baru diikuti oleh komponen ▲ Gambar
2d Meyer, 2004. Komponen yang telah terpisah akan dibawa oleh fase gerak menuju detektor dan sinyal yang terekam oleh detektor disebut sebagai puncak,
sedangkan keseluruhan puncak yang direkam oleh detektor selama analisis dinamakan kromatogram. Puncak yang diperoleh dalam analisis memiliki dua
informasi penting yakni informasi kualitatif dan kuantitatif Meyer, 2004.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2. Ilustrasi proses pemisahan yang terjadi di dalam kolom KCKT.
2.5.4 Parameter Dalam Kromatografi
