Tabel 2 Kelompok tikus percobaan sesuai perlakuan yang diberikan
Kelompok Tikus
Perlakuan A
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke- 21 kontrol negatif
B Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 1
L. plantarum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
C Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 2
L. fermentum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
D
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 1 L. plantarum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 serta dicekok
EPEC pada hari-8 sampai hari ke-14
E Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 2
L. fermentum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 serta dicekok EPEC pada hari-8 sampai hari ke-14
F Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok akuades mulai
hari ke-1 sampai hari ke- 21 serta cekok EPEC pada hari ke-8 sampai hari ke-14 kontrol positif
Jumlah BAL yang diberikan sesuai petunjuk Zoumpopolou et al. 2008. Dua buah kultur dari bakteri asam laktat terpilih L. plantarum dan L. fermentum
berumur satu hari pada media de Man Rogosa Sharpe Broth MRS Broth dengan populasi 10
8
cfumlhari diberikan sesuai dengan perlakuan kepada tikus percobaan. Sedangkan populasi EPEC penyebab diare yang diberikan adalah
sebesar 10
6
cfumlhari, yang didasarkan bahwa dosis infeksi E. coli enteropatogenik adalah minimal 10
5
cfuml menurut Oyetayo 2004. Setelah perlakuan tertentu selesai diaplikasikan pada tikus percobaan, dilakukan terminasi
pengakhiran perlakuan dengan selang waktu 7 hari. Pembunuhan tikus dilakukan dengan cara dislokatio cervicalis.
3.3.5 Pembuatan Preparat Histologi Jaringan Hati Tikus
Pembuatan preparat histologi meliputi proses pengambilan jaringan sampling, fiksasi, dehidrasi, penjernihan clearing, infiltrasi parafin,
embedding, pemotongan sectioning, dan pewarnaan staining Kiernan 1990. Pada proses terminasi, organ hati tikus diambil kemudian dicuci dengan NaCl
fisiologis 0.9. Selanjutnya organ dimasukkan ke dalam larutan fiksatif Bouin
yang telah disiapkan kurang lebih satu jam sebelum terminasi. Setelah terfiksasi, organ direndam dalam alkohol 70 stopping point. Selanjutnya sampel organ
hati dipotong kecil-kecil seperti dadu dan dimasukkan ke dalam tissue basket serta diberi label dengan kertas film. Sampel jaringan yang telah berada dalam tissue
basket didehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol 70, 80, 90, dan 95 masing-masing selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dalam
alkohol absolut 100 I, II, III masing-masing selama 1 jam. Setelah itu, dilakukan penjernihan clearing dalam xylol I, II, dan III masing-masing selama
1 jam dan dilanjutkan dengan infiltrasi parafin cair I, II, III pada suhu 60 °C selama masing-masing 1 jam.
Tahap selanjutnya adalah embedding, yaitu penanaman jaringan dalam blok parafin cetakan sehingga memudahkan pada saat pemotonganpenyayatan
dengan mikrotom. Blok parafin tersebut kemudian dipotong dengan mikrotom setebal 4 µ m. Proses ini disebut sectioning. Sebelum blok parafin dipasang pada
holder mikrotom, sebaiknya setiap sudut blok diiris sedikit sebagai pembatas antar potongan sehingga mudah dipisahkan setelah disayat. Hasil potongan
direndam dalam akuades suhu ruang. Setelah ditentukan hasil sayatan terbaik, sayatan tersebut dimasukkan ke dalam akuades yang dipanaskan dengan suhu
37 °C dalam waterbath. Selanjutnya sayatan jaringan dilekatkan pada gelas objek
dan diberi label untuk pewarnaan imunohistokimia, jaringan dilekatkan pada gelas objek dengan agen perekat neophren in toluene. Setelah itu, sediaan
diinkubasi dalam inkubator selama lebih kurang 24 jam. Proses berikutnya adalah pewarnaan staining. Pewarnaan diawali dengan
deparafinisasi dengan cara merendam gelas preparat dalam xylol III, II, I secara berurutan selama masing-masing 5 menit. Selanjutnya rehidrasi dilakukan dengan
merendam preparat dalam alkohol bertingkat mulai dari alkohol absolut III, II, I, 95, 90, 80, 70 selama masing-masing 5 menit, kemudan dilanjutkan
dengan perendaman preparat dalam air kran selama 5 menit dan dalam akuades selama 3 menit.
Pewarnaan Imunohistokimia Superoksida Dismutase Cu,Zn-SOD Pewarnaan ini dilakukan untuk mengamati kandungan enzim Cu,Zn-SOD
pada jaringan hati tikus percobaan. Dalam pewarnaan imunohistokimia terdapat
tahapan awal yang harus dilakukan, yaitu preparasi gelas objek dan pelapisan coating gelas objek dengan neofren in tholuene 2. Setelah prosedur
deparafinisasi dan rehidrasi dilakukan, tahap selanjutnya adalah penghilangan peroksidase endogen menggunakan substrat metanol 30 ml yang dicampur
dengan H
2
O
2
0.3 ml atau 3 H
2
O
2
dalam metanol disiapkan sesaat sebelum gelas objek dimasukkan dengan cara mencelupkan gelas preparat dan dibiarkan
dalam keadaan gelap selama 15 menit. Kemudian dilakukan pencucian dengan akuades dan phosphate buffer saline PBS masing-masing 2 kali selama 10
menit. Selanjutnya permukaan sediaan di sekitar jaringan dikeringkan menggunakan kertas tissue dengan tetap menjaga jaringan untuk tidak kering,
kemudian preparat disusun sejajar secara mendatar dalam kotak lembab untuk selanjutnya ditetesi 50-60 µl normal serum untuk masing-masing preparat. Kotak
kemudian ditutup rapat dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 °C selama
60 menit. Tujuan penetesan normal serum adalah untuk menutupi bagian antigen yang tidak spesifik pada jaringan agar tidak mengacaukan reaksi. Selanjutnya
dilakukan pencucian preparat dengan PBS sebanyak 3 kali selama masing-masing 5 menit.
Tahap selanjutnya adalah penetesan antibodi primer monoclonal antibody Cu,Zn-SOD SIGMA S2147 sebanyak 50-60 µ l pada masing-masing preparat,
lalu diinkubasi pada suhu 4 °C selama dua malam. Setelah diinkubasi, gelas
preparat dicuci kembali dengan PBS sebanyak tiga kali masing-masing 10 menit, kemudian ditetesi antibodi sekunder DEPS sebanyak 50-60 µ l per preparat pada
suasana gelap dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 60 menit. Sediaan dicuci
dengan PBS masing-masing 3 kali selama 5 menit kemudian ditetesi larutan kromogen DAB pada kondisi gelap dan di tutup selama 30 menit pada suhu ruang.
Selanjutnya preparat dicuci dengan air bebas ion milliQ dan kemudian dilakukan pengecekan dengan mikroskop cahaya. Adanya warna coklat menunjukkan hasil
positif. Proses selanjutnya adalah counterstain menggunakan pewarna hematoksilin untuk mewarnai sel yang tidak menghasilkan Cu,Zn-SOD dan
dilanjutkan dengan dehidrasi pada alkohol bertingkat 70, 80, 90, 95, absolut I, dan absolut II masing-masing beberapa detik serta absolut III selama 1
menit, dilanjutkan clearing dengan xylol I dan II selama beberapa detik serta xylol
III selama 1 menit. Proses diakhiri dengan mounting penutupan sediaan dengan cover glass menggunakan entelan.
Preparat yang telah selesai diwarnai diamati dengan mikroskop cahaya pada lensa objektif 20x pada tiap preparat. Pemotretan juga dilakukan dengan
pembesaran lensa objektif 20x pada preparat jaringan hati tersebut sebanyak enam lapang pandang secara acak pada setiap preparat.
3.3.6 Analisis Kandungan SOD Hati Tikus
