Alat-alat Penelitian Analisis Hasil

b. Media penumbuh sel HeLa : RPMI 1640 Sigma, Foetal Bovine Serum FBS 10 Gibco, Penisilin-Streptomisin 2 Gibco, dan Fungison 0,5 Gibco c. Media penumbuh sel Vero : M199 Sigma, Foetal Bovine Serum FBS 10 Gibco, Penisilin-Streptomisin 2 Gibco, dan Fungison 0,5 Gibco d. Reagen Stopper : natrium dodeksil sulfat 10 dalam HCl 0,01 N Merck e. MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazolium bromide 5 mgml Sigma f. Trypsin 0,25 Sigma

E. Alat-alat Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas Pyrex, mortir dan stamper, kain monel, sentrifuge Sigma K PLC series, spektrofotometer UV CECIL Serie 2 dan kuvet 1 ml, mikroskop Olympus Model IMT-2, haemocytometer Nebauer, laminar air flow Nuraire Class II type AB3, inkubator 37ºC, aliran 5 CO 2 Nuraire IR Airflow, 96-well plate Nunc, ELISA Reader SLT 340ATC, tissue culture flask, pipet Pasteur, membran tabung dialisis Sigma, tangki nitrogen cair, penangas air, almari es National, mikropipet, timbangan analitik AND ER-400 H, alumunium foil, magnetic stirrer, pH meter TOA electronic HM-5S, mesin vortex Thermolyne Maximi, autoklaf, Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85H, tissue, glove, dan masker. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

F. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku Backer and Backuizen van den Brink, 1963; 1965.

2. Pengumpulan daun mimba

Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada bulan Juni 2006.

3. Sterilisasi alat dan bahan

Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci dengan larutan sabun hingga bersih dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121 o C Gennaro, 2000.

4. Pembuatan fraksi protein dari daun mimba

Daun segar tanaman Azadirachta indica A. Juss dikumpulkan, diseleksi, dan dicuci bersih dengan air mengalir. Daun dipotong kecil-kecil, tulang daun dibuang dan ditimbang sebanyak 450 gram. Daun kemudian dibungkus dengan kantong plastik bersih dan disimpan dalam freezer –20ºC selama semalam, bersama dengan mortir, stamper, dan juga reagen-reagen yang akan digunakan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI untuk proses selanjutnya dimana bahan-bahan tersebut sebelumnya telah disterilkan. Daun ditumbuk halus dengan penambahan sesedikit mungkin dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl dalam mortir yang ditempatkan dalam baskom berisi air es. Hasil tumbukan diperas dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus pada 8000 rpm selama 30 menit. Supernatan dikumpulkan dalam labu ukur 500 ml yang bersih dan steril. Supernatan yang diperoleh kemudian diendapkan proteinnya dengan menambahkan 27,45 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer dan dijaga suhunya, kemudian didiamkan selama semalam di dalam lemari es sambil terus diaduk. Supernatan kemudian disentrifus lagi pada 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan 1 ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml. Supernatan 1 yang telah ditampung ditambahkan dengan 27,47 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan 1 disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan 2 ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Supernatan 2 yang ditampung ditambah dengan 28,35 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan 2 disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan 3 ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml. Supernatan 3 ditambah dengan 29,28 gram amonium sulfat perlahan- lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan 3 disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan 4 ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml. Langkah selanjutnya dilakukan dialisis dengan memasukkan keempat sampel fraksi protein yang diperoleh tadi ke dalam tabung dialisis dan direndam dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2, diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dalam lemari es. Hasil dialisis ditambahkan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl hingga volumenya mencapai 10 ml, sentrifus 8000 rpm selama 20 menit. Pelet dibuang sedang supernatan diambil sebagai sampel fraksi protein dengan konsentrasi 10 jenuh, sampel fraksi protein dengan konsentrasi 20 jenuh, sampel fraksi protein dengan konsentrasi 30 jenuh dan sampel fraksi protein dengan konsentrasi 40 jenuh. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

5. Pengukuran konsentrasi protein total

Fraksi protein 10, 20, 30 dan 40 jenuh yang diperoleh, masing- masing sebanyak 10 μl kemudian ditambah larutan dapar natrium fosfat 5mM hingga volumenya mencapai 1 ml. Ambil dan masukkan ke dalam kuvet. Ukur serapan dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Concentration = [1.55E280] – [0.76E260] mg ml -1 Layne cit., Richterich and Colombo, 1981

6. Propagasi dan panen sel HeLa

a. Propagasi sel HeLa Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan diatas penangas air 37ºC. Ampul disemprot dengan etanol 70 dan dibuka. Sel kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifus 8000 rpm selama 5 menit, supernatan yang didapat dibuang, kemudian medium RPMI diganti dengan yang baru, disuspensikan secara perlahan-lahan. Suspensi sel kemudian disentrifus lagi selama 5 menit. Supernatan dibuang sedang pelet ditambah dengan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 20 FBS. Disuspensikan perlahan hingga homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam 3-4 tissue culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37ºC dengan aliran 5 CO 2 . Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI b. Panen sel HeLa Setelah jumlah sel cukup, medium RPMI 1640 kemudian diganti dengan medium RPMI 1640 yang baru sebanyak 5 ml. Sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril, ditambah medium RPMI 1640 sampai volume 10 ml dan kemudian disentrifus 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang didapat dibuang sedang pelet diresuspensi kembali secara perlahan dengan 1 ml media. Jumlah sel dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel kemudian ditambahkan sejumlah medium sehingga diperoleh konsentrasi sel sebesar 5 x 10 4 sel 200 μl yang akan digunakan untuk penelitian.

7. Propagasi dan panen sel Vero

a. Propagasi sel Vero Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan diatas penangas air 37ºC. Ampul disemprot dengan etanol 70 dan dibuka. Sel kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium M199. Suspensi sel disentrifus 8000 rpm selama 5 menit, supernatan yang didapat dibuang, kemudian medium M199 diganti dengan yang baru, disuspensikan secara perlahan-lahan. Suspensi sel kemudian disentrifus lagi selama 5 menit. Supernatan dibuang sedang pelet ditambah dengan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 20 FBS. Disuspensikan perlahan hingga homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam 3-4 tissue culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37ºC dengan aliran 5 CO 2 . Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI b. Panen sel Vero Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, sel dicuci dengan FBS 10 sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask, diberi trypsin 0,25 sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan FBS 10 sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifus selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa trypsin, sel dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10 4 100 μl dan siap dipakai untuk penelitian Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.

8. Uji sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero

a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel HeLa Seratus μl suspensi sel HeLa dengan konsentrasi 5 x 10 4 sel 200 μl dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris sumuran. Sebagai kontrol, 100 μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya sel diinkubasikan dalam inkubator dengan aliran 5 CO 2 pada suhu 37ºC. Pada akhir PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI inkubasi, pada masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 mgml, dan diinkubasi lagi semalam pada suhu 37ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper, diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian serapan dapat dibaca dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm. b. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel Vero Seratus μl suspensi sel Vero dengan konsentrasi 5 x 10 4 sel 200 μl dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris sumuran. Sebagai kontrol, 100 μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium M199 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium M199 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya sel diinkubasikan dalam inkubator dengan aliran 5 CO 2 pada suhu 37ºC. Pada akhir inkubasi, pada masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 mgml, dan diinkubasi lagi semalam pada suhu 37ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper, diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian serapan dapat dibaca dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

G. Analisis Hasil

Prosentase kematian sel pada metode MTT adalah selisih absorbansi kontrol dengan absorbansi perlakuan dibagi absorbansi kontrol dikalikan 100 atau : Persen kematian = kontrol sel tanpa perlakuan - perlakuan - kontrol x 100 Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nochols, Mc Laughlin, 1982 Hasil uji berupa prosentase kematian sel tersebut kemudian dianalisis secara statistik menggunakan analisis probit untuk mengetahui konsentrasi protein yang dapat mengakibatkan kematian 50 populasi sel HeLa maupun sel Vero LC 50 . Analisis statistik menggunakan uji t-independent sample dilakukan untuk membandingkan daya sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa dengan sel Vero. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Preparasi Fraksi Protein Daun Mimba

Daun segar tanaman Azadirachta indica A. Juss yang telah dikumpulkan dan diseleksi, dicuci bersih dengan air mengalir supaya pengotor-pengotor yang menempel pada daun dapat dihilangkan. Daun dipotong dari tangkainya, kemudian digerus dengan penambahan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl sedikit demi sedikit dalam mortir yang ditempatkan dalam wadah berisi air es. Larutan dapar digunakan untuk menjaga stabilitas, sedangkan kandungan NaCl di dalam larutan dapar tersebut berfungsi untuk mempermudah kelarutan protein yang terkandung di dalam daun tanaman mimba. Penggerusan daun dalam mortir yang ditempatkan dalam wadah berisi air es dimaksudkan untuk menjaga temperatur percobaan supaya protein daun tetap stabil dan tidak mengalami kerusakan. Ekstrak gubal yang diperoleh dari 450 gram daun mimba sebanyak 515 ml. Pembuatan fraksi protein daun mimba Azadirachta indica A. Juss dilakukan dengan cara pengendapan protein menggunakan amonium sulfat. Mekanisme pengendapan protein dengan penambahan amonium sulfat ini disebut salting out. Amonium sulfat memiliki ion anorganik yang berkompetisi dengan molekul protein dalam mengikat air. Amonium sulfat dapat mengikat air lebih banyak daripada protein karena sifat amonium sulfat lebih polar dibandingkan protein sehingga kelarutan protein dalam air menurun dan dapat mengendap. 36 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI