F. Tatacara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia,
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku Backer and Backuizen van den Brink,
1963; 1965.
2. Pengumpulan daun mimba
Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada
bulan Juni 2006.
3. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat
tersebut dicuci dengan larutan sabun hingga bersih dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit
pada suhu 121
o
C Gennaro, 2000.
4. Pembuatan fraksi protein dari daun mimba
Daun segar tanaman Azadirachta indica A. Juss dikumpulkan, diseleksi, dan dicuci bersih dengan air mengalir. Daun dipotong kecil-kecil, tulang daun
dibuang dan ditimbang sebanyak 450 gram. Daun kemudian dibungkus dengan kantong plastik bersih dan disimpan dalam freezer –20ºC selama semalam,
bersama dengan mortir, stamper, dan juga reagen-reagen yang akan digunakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
untuk proses selanjutnya dimana bahan-bahan tersebut sebelumnya telah disterilkan.
Daun ditumbuk halus dengan penambahan sesedikit mungkin dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl dalam mortir yang
ditempatkan dalam baskom berisi air es. Hasil tumbukan diperas dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang
diperoleh disentrifus pada 8000 rpm selama 30 menit. Supernatan dikumpulkan dalam labu ukur 500 ml yang bersih dan steril.
Supernatan yang diperoleh kemudian diendapkan proteinnya dengan menambahkan 27,45 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk
menggunakan magnetic stirrer dan dijaga suhunya, kemudian didiamkan selama semalam di dalam lemari es sambil terus diaduk.
Supernatan kemudian disentrifus lagi pada 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan 1 ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang yang
diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml.
Supernatan 1 yang telah ditampung ditambahkan dengan 27,47 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic
stirrer selama semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan 1 disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan 2 ditampung
dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Supernatan 2 yang ditampung ditambah dengan 28,35 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama
semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan 2 disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan 3 ditampung dalam labu ukur
500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml.
Supernatan 3 ditambah dengan 29,28 gram amonium sulfat perlahan- lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan
dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan 3 disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan 4 ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet
yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml.
Langkah selanjutnya dilakukan dialisis dengan memasukkan keempat sampel fraksi protein yang diperoleh tadi ke dalam tabung dialisis dan direndam
dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2, diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dalam lemari es. Hasil dialisis ditambahkan larutan dapar
natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl hingga volumenya mencapai 10 ml, sentrifus 8000 rpm selama 20 menit. Pelet dibuang sedang
supernatan diambil sebagai sampel fraksi protein dengan konsentrasi 10 jenuh, sampel fraksi protein dengan konsentrasi 20 jenuh, sampel fraksi protein dengan
konsentrasi 30 jenuh dan sampel fraksi protein dengan konsentrasi 40 jenuh.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5. Pengukuran konsentrasi protein total
Kategori