b. Panen sel HeLa
Setelah jumlah sel cukup, medium RPMI 1640 kemudian diganti dengan medium RPMI 1640 yang baru sebanyak 5 ml. Sel dilepaskan dari dinding flask
dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril, ditambah medium RPMI 1640 sampai
volume 10 ml dan kemudian disentrifus 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang didapat dibuang sedang pelet diresuspensi kembali secara perlahan dengan 1
ml media. Jumlah sel dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel kemudian ditambahkan sejumlah medium sehingga diperoleh konsentrasi sel
sebesar 5 x 10
4
sel 200 μl yang akan digunakan untuk penelitian.
7. Propagasi dan panen sel Vero
a. Propagasi sel Vero
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan diatas penangas air 37ºC. Ampul disemprot dengan etanol 70 dan dibuka. Sel
kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium M199. Suspensi sel disentrifus 8000 rpm selama 5 menit, supernatan yang didapat
dibuang, kemudian medium M199 diganti dengan yang baru, disuspensikan secara perlahan-lahan. Suspensi sel kemudian disentrifus lagi selama 5 menit.
Supernatan dibuang sedang pelet ditambah dengan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 20 FBS. Disuspensikan perlahan hingga homogen, kemudian sel
ditumbuhkan dalam 3-4 tissue culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37ºC dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Panen sel Vero
Setelah jumlah sel cukup kurang lebih setelah berumur 7 hari, sel dicuci dengan FBS 10 sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask,
diberi trypsin 0,25 sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan
FBS 10 sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifus selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa trypsin, sel dicuci
sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah sel dengan
menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x10
4
100 μl dan siap dipakai untuk
penelitian Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989.
8. Uji sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero
a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel HeLa
Seratus μl suspensi sel HeLa dengan konsentrasi 5 x 10
4
sel 200 μl
dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan
sebanyak 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris sumuran. Sebagai kontrol, 100
μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 sedangkan
untuk faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi
medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya sel diinkubasikan dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2
pada suhu 37ºC. Pada akhir
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
inkubasi, pada masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 mgml, dan
diinkubasi lagi semalam pada suhu 37ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan
dengan penambahan reagen stopper, diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian serapan dapat dibaca dengan ELISA Reader pada panjang
gelombang 550 nm. b.
Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel Vero Seratus
μl suspensi sel Vero dengan konsentrasi 5 x 10
4
sel 200 μl
dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan
sebanyak 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris sumuran. Sebagai kontrol, 100
μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium M199 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 sedangkan untuk
faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium
M199 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya sel diinkubasikan dalam inkubator dengan aliran 5 CO
2
pada suhu 37ºC. Pada akhir inkubasi, pada masing-masing sumuran ditambahkan 10
μl MTT 5 mgml, dan diinkubasi lagi semalam pada suhu 37ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk
kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper, diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian
serapan dapat dibaca dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
G. Analisis Hasil
