BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni, yaitu penelitian dengan melakukan percobaan terhadap kelompok perlakuan dan
dibandingkan dengan kelompok kontrol yang tidak dikenai perlakuan. Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan penelitian acak lengkap pola searah,
yaitu cara menetapkan sampel dalam kelompok perlakuan dan kelompok kontrol dengan pengacakan agar setiap sampel punya kesempatan yang sama untuk dapat
masuk ke dalam kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol. Lengkap berarti bahwa pada penelitian ini terdapat kelompok kontrol positif, kelompok kontrol
negatif dan kelompok perlakuan. Pola searah ditunjukkan dengan adanya perlakuan yang sama pada setiap kelompok perlakuan, yaitu pemberian kombinasi
jus buah pare Momordica charantia L. dan jus buah naga merah Hylocereus purpusii L..
Penelitian ini dilakukan pada subjek uji tikus jantan galur Wistar. Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan umur 2-3
bulan dan bobot hewan uji 175-250 gram. Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah tikus putih jantan galur Wistar dengan umur diluar 2-3 bulan dan berat
badan diluar 175-250 gram.
31
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel Utama
a Variabel bebas. Variabel bebas dari penelitian ini adalah kombinasi dosis
antara jus buah pare dengan jus buah naga merah. Dosis yang digunakan adalah jumlah mililiter jus buah pare Momordica charantia L. dan jus
buah naga merah Hylocereus purpusii L. tiap kilogram berat badan hewan uji.
b Variabel tergantung. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah efek
hipoglikemik setelah pemberian jus buah pare dan jus buah naga dilihat dari kadar LDDK
0-240
glukosa dalam darah tikus jantan galur Wistar.
2. Variabel Pengacau
a Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali pada
penelitian ini yaitu : 1
Subjek uji : tikus putih
2 Jenis Kelamin
: jantan 3
Galur spesies subjek uji : Galur Wistar
4 Umur hewan uji
: 2-3 bulan 5
Bobot hewan uji : 175-250 gram
6 Cara pemberian jus
: per oral b
Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini yaitu:
1 Variabel biologis tikus putih jantan yaitu proses absorbsi, distribusi,
biotransformasi, dan ekskresi dari tikus jantan terhadap campuran jus
buah pare Momordica charantia L. dan jus buah naga merah Hylocereus purpusii L..
2 Umur tanaman buah pare Momordica charantia L. dan buah naga
merah Hylocereus purpusii L. serta jumlah kandungan kimia buah pare Momordica charantia L. dan buah naga merah Hylocereus
purpusii L..
3. Definisi Operasional
a. Jus campuran buah pare dan buah naga merah adalah campuran buah pare
dan buah naga merah yang dilumatkan menggunakan mesin jus ekstraktor menjadi cairan yang berisi saripati untuk diminum dan umumnya memiliki
manfaat yang baik bagi kesehatan. b.
Dosis kombinasi jus buah pare Momordica charantia L. dan jus buah naga merah Hylocereus purpusii L. adalah sejumlah volume jus buah pare dan
jus buah naga merah yang dicampur dengan perbandingan tertentu dengan satuan mLkg BB.
c. Uji Toleransi Glukosa Oral UTGO merupakan suatu metode penetapan
kadar glukosa darah dengan cara memberikan beban glukosa terhadap tikus dengan larutan glukosa secara oral dengan dosis 1,75 gkg BB.
d. LDDK
0-240
kadar glukosa dalam darah adalah besaran yang menggambarkan jumlah kadar glukosa dalam darah pada rentang waktu mulai menit ke-0
sampai menit ke-240 yang dihitung menggunakan metode trapezoid.
C. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan Penelitian
a. Hewan uji. Tikus jantan galur Wistar dengan umur 2-3 bulan dan berat
badan 175-250 gram yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
b. Bahan Uji. Buah pare yang diperoleh di pasar Pakem Yogyakarta dengan
waktu panen 2,5 bulan sejak tanam benih, panen selanjutnya dengan interval 7 hari. Buah naga merah yang diperoleh dari salah satu perkebunan di
Bangka Belitung dengan waktu panen 30-50 hari setelah bunga mekar. c.
Senyawa pembanding. Senyawa pembanding berupa kaplet generik Glibenklamida yang diproduksi oleh PT. Indofarma.
d. Pereaksi untuk pengukuran kadar glukosa darah. Pereaksi yang digunakan
adalah enzim Glucose GOD FSDiaSys
®
, Germany, yang komposisinya terdiri atas:
Tabel I. Isi pereaksi enzim Glucose GOD-PAP
Reagen : Phosphat buffer
pH 7,5 250 mmoll
Phenol 5 mmoll
4-aminoantipyrine 0,5 mmoll
Glukosa oksidase GOD
≥ 10 kUl Phenol Amino Antipirin
Peroksidase PAP
≤ 1 kUl Glukosa standar
100mgdl 5,5 mmoldl
e. Lain-lain
1 Heparin sebagai antikoagulan.
2 Glukosa monohidrat p.a Merck
®
dengan dosis 1,75 gkg BB sebagai larutan untuk uji toleransi glukosa oral.
3 CMC 1 sebagai kontrol negatif dan pelarut Glibenklamida.
4 Aquadest sebagai cairan pelarut untuk pembuatan sediaan uji yang
diperoleh dari Laboratorium Farmakologi - Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
5 Parafin cair sebagai pelancar aliran darah dalam pengambilan sampel
darah dari hewan uji.
2. Alat Penelitian
a. Seperangkat alat gelas Pyrex Beaker glass, labu takar, gelas ukur,
pengaduk
b.
Mortir dan stamper
c. Jarum suntik injeksi peroral yaitu jarum suntik yang ujungnya diberi
bulatan kecil dengan lubang ditengahnya agar tidak melukai hewan uji
d.
Mikropipet
e. Sentrifuge Hettich WBA SS
®
, Germany, yellow tipe, microtube
f.
MicroVitalab
g. Alat timbang elektrik Mettler Toledo AB 204
®
, Switzerland
h. Vortex Janke-Kankel IKA
®
- Labortechnik
i.
Jus extractor
j. Stopwatch Olympic
®
D. Tata Cara Penelitian
1.
Determinasi tanaman
Determinasi dilakukan dengan menyamakan ciri - ciri buah pare dan buah naga merah berdasarkan buku Flora Untuk Sekolah di Indonesia 1988
dan jurnal Pithaya Hylocereus spp. : a new fruit crop, a market with a future Bellec, Vaillant, Imbert, 2006.
2.
Pengumpulan bahan
Buah pare dan buah naga merah yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah yang masih segar yang diperoleh dari pasar Pakem Yogyakarta
buah pare dengan waktu panen pertama 2,5 bulan setelah tanam benih, panen berikutnya dilakukan secara periodik dua kali dalam seminggu dan perkebunan
buah naga di Bangka Belitung buah naga merah dengan waktu panen 30-50 hari setelah bunga mekar.
3.
Pembuatan jus buah pare dan jus buah naga merah
Daging buah pare dan buah naga merah dijus secara terpisah dengan jus extractor sehingga didapatkan sari buah pare dan buah naga merah secara
terpisah. Pencampuran jus buah pare dan jus buah naga merah dilakukan didalam spuit injeksi oral.
Pembuatan stok jus buah pare yakni sebanyak 145 gram buah pare dijus menggunakan jus ekstraktor menghasilkan 75 mL. Hasil sari buah pare yang di
dapat selanjutnya digunakan sebagai bahan percobaan. Stok buah naga merah di dapat dari 125 gram buah naga merah dijus menggunakan jus ekstraktor
menghasilkan 87 mL. Hasil sari buah naga merah tersebut kemudian digunakan sebagai bahan percobaan.
4.
Perhitungan dosis pemberian campuran jus buah pare dan jus buah naga merah
Penentuan dosis kombinasi jus buah pare dan jus buah naga merah didasarkan pada volume maksimal pemberian untuk tikus secara oral. Buah
pare dan buah naga merah dijus secara terpisah menggunakan jus ekstraktor. Volume maksimal yang dapat dipejankan secara oral yakni 5 mL200g BB =
25 mLKg BB. Berdasarkan hasil studi Welihinda Wiart, 2002, pemberian jus segar
Momordica charantia L. 50-60 mL rata-rata 55 mL dapat memperbaiki 73 nilai toleransi glukosa pada penderita DM tipe 2. Perhitungan dosis untuk tikus
= 55 mL x 0,018 = 0,99 mL dibulatkan menjadi 1 mL200g BB = 5 mLKg BB sebagai dosis maksimal buah pare dalam penelitian ini.
Dosis buah naga ditentukan berdasarkan volume maksimal yang dapat diberikan untuk tikus. Volume pemberian maksimal untuk tikus adalah
25 mLKg BB. Dosis maksimal jus buah pare yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5 mLKg BB tikus, maka dosis maksimal jus buah naga yang
digunakan sebesar 20 mLKg BB tikus, sehingga didapatkan volume maksimal kombinasi jus buah pare dan jus buah naga merah sebesar 25 mLKg BB.
Peringkat dosis kombinasi untuk buah pare dalam percobaan ini adalah 3,75 mLKg BB; 2,5 mLKg BB dan 1,25 mLKg BB. Peringkat dosis untuk
buah naga merah yakni 15 mLKg BB; 10 mLKg BB dan 5 mLKg BB. Dosis
kombinasi jus buah pare dan jus buah naga yang digunakan pada percobaan ini adalah :
Dosis 1 = pare 1,25 mLKg BB : naga 15 mLKg BB Dosis 2 = Pare 2,5 mLKg BB : naga 10 mLKg BB
Dosis 3 = pare 3,75 mLKg BB : naga 5 mLKg BB
5.
Preparasi bahan a.
Pembuatan larutan stok glukosa p.a. 15,0 bv. Glukosa monohidrat p.a.
ditimbang sebanyak 3,75 gram dan dilarutkan dengan aquadest panas
dalam labu takar 25,0 mL sampai tanda. b.
Pembuatan larutan CMC 1 bv. CMC ditimbang sebanyak 1 gram dan dilarutkan dengan aquadest dalam labu takar 100 mL sampai tanda.
c. Penentuan dosis Glibenklamida. Dosis Glibenklamida yaitu 5 mg pada
manusia dengan berat badan 50 kg.
Untuk manusia 70 kg : =
= 7 mg dikonversikan ke tikus 200 gram dengan faktor konversi 0,018.
7 mg glibenklamida x 0,018 = 0,126 mg 200 gram = 0,63 mg Glibenklamidakg BB
Berdasarkan perhitungan maka besarnya dosis Glibenklamida pada hewan uji tikus yaitu 0,63 mgkg BB.
d. Penentuan keseragaman bobot kaplet Glibenklamida. Penentuan
keseragaman bobot kaplet Glibenklamida mengacu pada Depkes 1979. Timbang 20 tablet, hitung bobot tablet. Jika ditimbang satu-satu, tidak
boleh lebih dari 2 tablet yang masing-masing bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata lebih besar dari harga yang ditetapkan kolom A, dan tidak
satu tabletpun menyimpang dari bobot rata-ratanya lebih dari harga yang ditetapkan kolom B. Nilai penyimpangan bobot rata-rata kolom A dan B
dapat dilihat pada Tabel II.
Tabel II. Keseragaman Bobot Tablet Depkes RI, 1979 Bobot rata-rata
Penyimpangan bobot rata-rata dalam
A B
25 mg atau kurang 15 30
26 mg sampai dengan 150 mg 10
20
151 mg sampai dengan 300 mg
7,5 15
Lebih dari 300 mg 5
20
e. Pembuatan suspensi Glibenklamida 0,1125 mgmL
Timbang serbuk Glibenklamida setara dengan 25 mg Glibenklamida murni, larutkan dengan CMC 1 dalam labu takar 10 mL sampai tanda sebagai
suspensi induk Glibenklamida. Buat dengan konsentrasi 0,1125 mgmL yaitu mengambil 0,45 mL suspensi induk add aquadest dalam labu ukur 10
mL hingga tanda. Perhitungan volumenya yaitu: C
1
= 25 mg10 mL = 2,5 mgmL ; C
2
= 0,1125 mgmL 2,5 mgmL x V
1
= 10,0 mL x 0,1125 mgmL V
1
= 0,45 mL
6.
Percobaan pendahuluan
a. Penetapan waktu pemberian Glibenklamida
Tujuan dari penetapan waktu pemberian Glibenklamida adalah untuk melihat pengaruh waktu pemberian terhadap efek hipoglikemik
Glibenklamida, agar pada saat Uji Toleransi Glukosa Oral UTGO,
Glibenklamida sudah memberikan efek penurunan kadar glukosa darah. Orientasi ini menggunakan 6 ekor tikus yang terbagi dalam 3 kelompok.
Perlakuan tersebut dilakukan terhadap masing-masing kelompok yaitu pada menit ke-15 sebelum UTGO untuk kelompok kesatu, menit ke-30 sebelum
UTGO untuk kelompok kedua, dan menit ke-45 sebelum UTGO untuk kelompok ketiga. Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya
dilakukan UTGO dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15,0 bv; 1,75 gkgBB. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum
perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, dan 240 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan
dengan menggunakan metode GOD-PAP, selanjutnya dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDDK
0-240
. Penentuan waktu pemberian Glibenklamida didasarkan pada harga LDKK
0-240
terendah.
7.
Tahap percobaan
a. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Penelitian ini mengikuti rancangan acak lengkap pola searah, yang mana tiga puluh lima ekor tikus dibagi secara acak menjadi 7 kelompok, masing-
masing kelompok terdiri dari 5 ekor. Tiap hewan uji diadaptasikan dengan kondisi yang sama, jauh dari kebisingan dan dihindarkan dari stress.
Sebelum mendapat perlakuan, masing masing kelompok dipuasakan selama 16-18 jam dengan tetap diberi minum add libitum, lalu diberi
perlakuan sebagai berikut:
1 Kelompok I yaitu pemberian CMC Na 1 25 mLkg BB kontrol
negatif 2
Kelompok II yaitu pemberian suspensi Glibenklamida 0,63 mgkg BB kontrol positif
3 Kelompok III yaitu pemberian dosis maksimal jus daging buah pare
dosis 5 mLKg BB kontrol pare 4
Kelompok IV yaitu pemberian dosis maksimal jus buah naga merah dosis 20 mLKg BB kontrol buah naga
5 Kelompok V yaitu pemberian kombinasi dosis 1 pare 1,25 mLKg BB
: naga 15 mLKg BB 6
Kelompok VI yaitu pemberian kombinasi dosis 2 pare 2,5 mLKg BB : naga 10 mLKg BB
7 Kelompok VII yaitu pemberian kombinasi dosis 3 pare 3,75 mLKg
BB : naga 5 mLKg BB Semua pemberian dilakukan secara peroral, selanjutnya dilakukan UTGO
dengan diberikan larutan glukosa monohidrat 15,0 bv; 1,75 gKg BB 30 menit setelah perlakuan. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat
sebelum UTGO sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, dan 240 setelah UTGO. Pengukuran kadar glukosa darah
dilakukan dengan menggunakan metode GOD-PAP, selanjutnya dibuat kurva UTGO dan perhitungan harga LDDK
0-240
.
b. Penetapan kadar glukosa darah
Kadar glukosa darah ditetapkan dengan metode GOD-PAP. Tiap kelompok dilakukan pengambilan cuplikan darah sebanyak 0,5 mL
melalui vena lateralis ekor dan ditampung dalam microtube yang berisi 3 tetes heparin. Pengambilan cuplikan darah dilakukan sesaat sebelum
perlakuan sebagai menit ke-0 dan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, dan 240 setelah UTGO. Darah kemudian dipusingkan 3000 rpm
selama 10 menit, selanjutnya diambil 0,01 mL plasma darah dan dilakukan pengukuran seperti dalam Tabel III.
Tabel III. Volume Pengukuran Kadar Glukosa Darah Bahan
Sampel mL Standar mL
Blangko mL Supernatan
0.01 -
- Larutan baku glukosa
- 0,01
- Pereaksi GOD-PAP
1 1
1
Bahan-bahan tersebut dicampur dan diinkubasi selama operating time. Kadar glukosa darah ditetapkan dengan alat micro vitalab
menggunakan metode GOD-PAP, dinyatakan dalam mgdL. Pengukuran kadar glukosa dilakukan di laboratorium Fisiologi-Biokimia Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selanjutnya dibuat kurva dengan mem-plot-kan nilai kadar glukosa
darah lawan waktu ke-0 sampai menit ke 240 dengan metode trapezoid LDDK
0-240
dan rumus yang digunakan adalah sebagai berikut:
= −
2 ×
+ +
− 2
× +
+ −
2 ×
+ +
− 2
× +
Keterangan: t
= waktu jam-1menit-1 C
= konsentrasi zat dalam darah mgmL LDDK
to-tn
= luas daerah di bawah kurva dari waktu ke-0 sampai ke-n
E. Tata Cara Analisis Hasil
Kategori