Metode Penatalaksanaan Penelitian .1 Bahan Penelitian

Tabel 2 Lanjutan No. Variabel Definisi Operasional Satuan Ukur Skala Ukur Alat Ukur 4 Ekstrak etanol daun Afrika konsentrasi 12,5, Ekstrak yang didapat dengan mengambil 0,125ml dari konsentrasi ekstrak etanol daun Afrika 25 dan dilarutkan dalam 0,875 ml aquabides. Milliliter Nominal Mikropipet 5 Ekstrak etanol daun Afrika konsentrasi 6,25, Ekstrak yang didapat dengan mengambil 0,0625ml dari konsentrasi ekstrak etanol daun Afrika 12,5 dan dilarutkan dalam 0,9375mlaquabides. Mililiter Nominal Mikropipet 6 Ekstrak etanol daun Afrika konsentrasi 3,125, Ekstrak yang didapat dengan mengambil 0,0416ml dari konsentrasi ekstrak etanol daun Afrika 6,25 dan dilarutkan dalam 0,958 ml aquabides Milliliter Nominal Mikropipet Variabel Tergantung No Variabel Definisi Operasional Cara Ukur Skala Ukur Alat Ukur 1 KHM Kadar hambat maksimal Konsentrasi minimal bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri 50 setelah diinkubasi 24 jam. CFUml colony forming unitmillimeter Rasio Visual 2 KBM Kadar bunuh minimal Konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 99.9 bakteri setelah di inkubasi 24 jam. CFUml colony forming unitmillimeter Rasio Visual 4.5 Metode Penatalaksanaan Penelitian 4.5.1 Bahan Penelitian Bahan penelitian yang digunakan adalah : 1. Daun Afrika Vernonia amygdalina 2 kg yang dipetik di Medan, Sumatera Utara, Indonesia 2. Etanol 70 sebanyak 5 liter Kimia Farma, Indonesia 3. Akuades 1 liter Kimia Farma, Indonesia 4. Streptococcus mutans ATCC 25175 USU, Indonnesia Universitas Sumatera Utara 5. Media Mueller Hinton Agar Difco, USA 6. NaCl 0,9 Kimia Farma, Indonesia 7. Media blood agar

4.5.2 Alat Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah : 1. Timbangan Home Line, China 2. Timbangan analaitik Vibra, Japan 3. Kertas perkamen 2 kajang 4. Blender Panasonic, Japan 5. Kapas 250gr Bio Panca, Indonesia 6. Kertas saring Whatman no.42, England 7. Aluminium foil 1 gulungan Total Wrap, Indonesia 8. Perkolator 9. Erlenmeyer Pyrex, USA 10. Vaccum rotavaporStuart, 2010 11. Electronic balance Ohyo, JP2 6000, Japan dan Denver Instrument Company, USA 12. Autoklaf Tomy, Japan 13. Vortex Iwaki model TM-100, Japan 14. Inkubator Sanyo, Japan 15. Pipet mikro Gilson, France 16. Piring petri Pyrex, Japan 17. Ose dan Bunsen 18. Pinset 19. Mikroskop 20. Tabung reaksi + Rak 21. Densi check 22. BSC Bio Safety Cabinet Universitas Sumatera Utara 4.5.3 Prosedur Penelitian 4.5.3.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Afrika Vernonia Amygdalina Proses pembuatan ekstrak etanol daun Afrika Vernonia amygdalina dilakukan berdasarkan standar operasional prosedur laboratorium obat tradisional Fakultas Farmasi USU dengan langkah-langkah sebagai berikut : a. Pembuatan simplisia Daun Afrika Vernonia amygdalina dipetik dan ditimbang sebanyak 2 kg Gambar 3. Kemudian dikeringkan didalam lemari pengering dengan suhu 40ºC hingga kering Gambar 4.Daun dikatakan sudah kering apabila diremas akan mudah hancur. Selanjutnya daun Afrika Vernonia amygdalina yang telah kering tersebut dihaluskan dengan diblender Gambar 5. Sehingga didapat serat-serat halus Simplisia daun Afrika Vernonia amygdalina Gambar 6. Gambar.3. Penimbangan daun Afrika Gambar 4. Pengeringan daun Afrika Universitas Sumatera Utara Gambar 5.Daun Afrika dihaluskan Gambar 6. Simplisia daun Afrika b. Proses Maserasi Sebanyak 350 gr simplisia diletakkan dalam bejana tertutup dan direndam dengan etanol 70 dengan suhu 25ºC. Gambar 7. Proses Maserasi c. Proses Perkolasi Perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas secukupnya pada bagian dasar wadah percolator. Diatas kapas tersebut diletakkan kertas saring sebanyak 2 lembar. Kemudian, massa simplisia yang telah direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit kedalam perkolator dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dengan sendok. Setelah itu etanol 70 dituangkan kedalam perkolator dan massa disaring dengan lapisan kertas saring sambil cairan tersebut mulai menetes dan diatas Universitas Sumatera Utara simplisia masih terdapat selapis cairan penyaring untuk mengetahui apakah perkolator sudah berfungsi dengan baik. Perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 mlmenit atau 20 tetesmenit. Tambahkan etanol 70 secukupnya dengan berulang-ulang sehingga selalu terdapat selapis cairan penyaring diatas simplisia, hingga diperoleh ekstrak airgambar 8. Ekstrak air diuapkan dengan Vacum rotavapor pada suhu 40ºC hingga konsestisensi seperti madu gambar 10. Gambar 8. Proses Perkolasi Gambar 9. Vacuum rotavapor

4.5.3.2 Pengenceran Bahan Coba

Ekstrak daun Afrika Vernonia amygdalina dalam etanol ditimbang menggunakan eletronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengancara dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth MHB. Universitas Sumatera Utara Disediakan 6 buah tabung, pada masing-masing tabung diisi 1 ml MHB. Pada tabung pertama diisi ekstrak kental daun Afrika Vernonia amygdalina kemudian divortex sehingga diperoleh ekstrak daun Afrika Vernonia amygdalina dengan konsentasi 100. Kemudian dilakukan pengenceran dengan cara pengambilan setengah dari ekstrak daun Afrika Vernonia amygdalina konsentrasi 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak daun Afrika Vernonia amygdalina konsentrasi 50 pengenceran ganda. Demikian seterusnya sampai tabung ke-6 sehingaa dihasilkan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125. Beri label pada setiap label sesuai konsentrasinya.

4.5.3.3 Pembuatan Media Bakteri

Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dahulu dibuat media Mueller Hinton Agar MHA, sebanyak 12 gram dilarutkan dalam 240 ml aquades kemudian dituangkan ke dalam pertri 20 mlpetri lalu dipanaskan diatas tunggu pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 151ºC.Kemudian media disimpan ke dalam lemari pendingin. Jika digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.

4.5.3.4 Pembiakan Spesimen

Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob. Streptococcus mutans yang digunakan adalah spesimen Streptococcus mutans ATCC 25175 yang telah dibiakkan secara murni pada media Mueller Hinton Broth MHB yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur di suspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10 6 CFUml. Universitas Sumatera Utara Gambar 10. Streptococcus mutans ATCC 25175

4.5.3.5 Penentuan KHM Bahan Coba

Bahan coba ekstrak daun Afrika Vernonia amygdalina yang digunakan terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125. Dari masing- masing konsentrasi tersebut, diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunkan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian dicampurkan dengan vortex, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabun-tabung tersebut dengan kontrol Mc Farland untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan coba apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Streptococcus mutans dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.

4.5.3.6 Penentuan KBM Bahan Coba

Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni bakteri yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125 dengan metode Drop Plate Miles Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing divorteks dan diambil 50µl untuk tiap konsentrasi lalu Universitas Sumatera Utara diteteskan ke dalam media padat Mueller Hilton BrothMHB, direplikasi 4 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dengan suhu 37°C selama 24 jam dan media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan KBM dengan bantuan kaca pembesar. Perhitungan adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dengan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.

4.6 Pengolahan dan Analisis Data

Dokumen yang terkait

Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai Bahan Alternatif Medikamen Saluran Akar terhadap Porphyromonas gingivalis (In Vitro)

39 299 83

Daya Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai Bahan Alternatif Medikamen Saluran Akar terhadap Fusobacterium Nucleatum (Penelitian InVitro)

12 103 68

Daya Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernoniaamygdalina) Sebagai Bahan Alternatif Medikamen Saluran Akar Terhadap Enterococcus Faecalis(Secarain Vitro)

21 182 71

Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai bahan Alternatif medikamen saluran akar terhadap Streptococcus mutan (in vitro)

0 0 14

Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai bahan Alternatif medikamen saluran akar terhadap Streptococcus mutan (in vitro)

0 1 6

Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai bahan Alternatif medikamen saluran akar terhadap Streptococcus mutan (in vitro)

1 1 11

Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai bahan Alternatif medikamen saluran akar terhadap Streptococcus mutan (in vitro)

1 1 4

Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai bahan Alternatif medikamen saluran akar terhadap Streptococcus mutan (in vitro)

0 0 27

Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai Bahan Alternatif Medikamen Saluran Akar terhadap Porphyromonas gingivalis (In Vitro)

1 2 5

Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina) sebagai Bahan Alternatif Medikamen Saluran Akar terhadap Porphyromonas gingivalis (In Vitro)

0 0 12