Z= confidence level = 95 D=worst
acceptable=10 P= expected frequency=25 Sopacoa Kar, 2003
N= jumlah sampel minimal=32
5. Pelaksanaan Penelitian
Kepada semua subjek yang ikut dalam penelitian sebelumnya diterangkan tujuan, prosedur, manfaat, resiko sebagai subjek dalam penelitian dan perasaan
yang tidak menyenangkan yang mungkin ada akibat pelaksanaan prosedur penelitian. Kepada semua subjek penelitian dimintakan sewaktu datang untuk
pengambilan sampel, untuk membawa rekam medik catatan kesehatan jika ada yang berhubungan dengan riwayat demam, malaria, penyakit kurang darah anemia.
Semua subjek yang setuju ikut dalam penelitian, diminta menanda tangani persetujuan secara tertulis untuk mengikuti penelitian informed consent.
Lembar Wawancara 1.
6. Prosedur Pemeriksaan
Diambil sampel darah dari semua subjek penelitian, kemudian diperiksa aktifitas enzim G6PD sel eritrosit dan konsentrasi Hb untuk menentukan aktifitas
G6PD dan defisensi G6PD. Dengan menggunakan lembar wawancara 2, di anamnesa riwayat infeksi malaria
pada subjek penelitian untuk mendapat kelompok penelitian yang pernah terinfeksi malaria, dan kelompok yang tidak pernah terinfeksi malaria.
Pemeriksaan aktifitas G6PD
Prinsip: Aktifitas enzim G6PDH ditentukan dengan mengukur terbentuknya NADPH
melalui peningkatan absorpsi sinar ultraviolet pada panjang gelombang 340 nm dengan metode UV spektrofotometer.
G6PDH
G6P + NADP 6 Fosfoglukonat + NADPH +H
+
Alat : 1.
Spuit 3 ml 7. Pipet effendorf
2. Tabung vakum EDTA 3 ml
8. Tips steril berbagai ukuran 3.
Spektrofotometer 9. Centrifuge
4. Tabung reaksi
10. Waterbath 5.
Tabung falcon centrifuge 11. Kulkas
6. Vortex
Reagensia: A. Kit Glucose 6 Phosphate Dehydrogenase yang terdiri dari
1. Buffer Triethanolamine Buffer
: 31,7 mmoll, pH 7,6 EDTA
: 3,2 mmoll 2.
NADP : 0.34 mmoll
3. Glucose 6 phosphate
: 0.34 mmoll 4.
Digitonin : 0.58 mmoll
B. NaCl 0,9
Cara kerja:
1. Dilakukan pengambilan 3 ml darah vena, masukkan ke dalam tabung
vakum EDTA 2.
0,2 ml darah ini dicuci dengan 2 ml NaCl 0,9 3.
Kemudian larutan di centrifuge selama 10 menit pada 3000 rpm, ulangi 3x 4.
Selanjutnya eritrosit di suspensikan dengan 0,5 ml larutan digitonin 5.
Larutan di simpan 15 menit pada suhu +4 °C, kemudian di centrifuge
kembali 6.
Pengukuran supernatant haemolysate dilakukan dalam waktu 2 jam 7.
Ke dalam cuvette di pipetkan: 1.
Buffer 3,00
ml 2.
NADP 0,10
ml 3.
Haemolysate 0,05 ml
8. Campur larutan, inkubasi 5 menit pada suhu 25
°C, tambahkan Glucose 6 phosphate 0,05 ml
9. Pada panjang gelombang 340 nm baca absorbpsi awal, kemudian absorpsi
dibaca kembali setiap 60 detik selama 3 menit. Perhitungan
Untuk menghitung aktifitas enzim G6PDH menggunakan rumus: mUml eritrosit = 30476 x
Δ A 340 nmmin
Diukur aktifitas G6PD 3 kali, selisihnya 3koefisiensi faktor dibg nilai RBC
RBC eritrosit
ml mU
eritrosit mU
10
9
=
Hb eritrosit
ml mU
gHb mU
100 ×
=
Hb= konsentrasin hemoglobin yang ditentukan untuk masing-masing sampel Nilai aktifitas G6PD dalam sel eritrosit normal
=118-144 mU10
9
Ery =6,97-20,5
UgHb 37
° Lohr and Waller, 1974 Defisiensi G6PD = residu aktifitas G6PD 118 mU10
9
Ery atau 6,97-20,5 UgHb
Pemeriksaan Hb Alat : 1. Tabung reaksi
2. Pipet Sahli 3. Pipet effendorf
4. Tips steril 5. Vortex
6. Spektrofotometer Reagensia : Kit Hb dengan komposisi
1. Potassium Ferricyanide
0,61 mmoll 2.
Potassium Cyanide
0,77 mmoll
3. Potassium
Phosphate 1,03
mmoll 4.
Surfactant 0,1
vv
Cara pemeriksaan: 1.
Terhadap 20 μl darah , dicampur dengan anti koagulan EDTA
2. Darah yang mengandung antikoagulan dimaasukkan ke dalam tabung yang
telah diisi dengan 5 ml larutan Hb 3.
Dibiarkan lebih kurang selama 3 menit pada suhu kamar 4.
Absorbsi larutan dibaca pada panjang gelombang 540 nm Nilai Hb: 14-18 gdl laki-laki
Van Kampen and Zijlstra, 1961
7. Analisa Data
Kategori