Waktu dan Tempat Prosedur Analisis Data

13 Tabel 3 Karakteristik sifat biokimia dan fisiologis bakteri probiotik SKT-b Parameter Keterangan Gram Negatif Bentuk sel Batang pendek Motilitas + Protease + Amilase + Kitinase - Sumber karbon:  Glukosa +  Sukrosa +  Laktosa -

3.2.3 Uji Kombinasi Sinbiotik Optimal

Pengujian kombinasi prebiotik-probiotik sinbiotik yang optimal dilakukan secara in vitro. Pengujian ini mencari kombinasi prebiotik-probiotik yang memperlihatkan kecepatan pertumbuhan bakteri probiotik paling baik. Biakan cair bakteri SKT-b konsentrasi 10 7 , 10 8 , 10 9 , dan 10 10 cfu ml -1 , masing-masing sebanyak 1 ml ditumbuhkan dalam 9 ml air laut steril yang telah dicampur dengan prebiotik konsentrasi 0, 1, 2 dan 3 vv. Sterilisasi prebiotik dilakukan dengan filtrasi mess size 0,20 µm. Biakan bakteri selanjutnya diinkubasi dalam waterbath shaker kecepatan 140 rpm, suhu 29 o C selama 12 jam. Pertumbuhan bakteri SKT-b diketahui dengan mengukur nilai absorbansi biakan setiap perlakuan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.

3.2.4 Uji In Vivo

3.2.4.1 Preparasi Probiotik

Bakteri probiotik yang akan diberikan ke udang, sehari sebelumnya dikultur di media SWC cair dan diinkubasi dalam waterbath shaker kecepatan 140 rpm, suhu 29 o C selama 16 jam. Pelet bakteri dipisahkan dengan supernatan menggunakan sentrifus kecepatan 10.000 rpm selama lima menit. Pelet bakteri dicampurkan ke pakan sebanyak 10 10 cfu g pakan -1 .

3.2.4.2 Preparasi Pakan

Bakteri SKT-b dan prebiotik sesuai dosis perlakuan ditambahkan ke pakan komersil menggunakan pengikat berupa gelatin sebanyak 3 dari bobot pakan. Pakan untuk udang kontrol juga ditambahkan gelatin 3 tanpa sinbiotik. Pelet dikeringanginkan selama 30 menit dan segera diberikan ke udang sebanyak satu kali setiap hari selama 30 hari. Pembuatan pakan perlakuan dilakukan setiap hari untuk menjaga kesegaran bahan. 14

3.2.4.3 Persiapan Wadah dan Media

Wadah perlakuan berupa akuarium kaca berukuran 60x30x40 cm 3 . Sebelum digunakan, wadah didesinfeksi dengan klorin 100 ppm selama satu jam. Wadah dibilas air sampai bersih dan dijemur di bawah sinar matahari untuk menghilangkan residu klorin. Akuarium kemudian ditutup dengan plastik hitam untuk mengurangi intensitas cahaya yang masuk. Masing-masing akuarium dilengkapi dengan shelter pipa paralon ½ inci dan “anco” tutup toples plastik diameter 18 cm. Air yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Pantai Ancol. Air laut ditampung dalam tandon dan didesinfeksi dengan klorin 30 ppm. Residu klorin dihilangkan dengan menambahkan Na-Thiosulfat 15 ppm setengah dosis klorin. Setiap akuarium perlakuan diisi air laut setinggi 30 cm 54 liter. Akuarium dengan perlakuan yang sama digabung dalam satu sistem resirkulasi untuk mempertahankan kualitas air media pemeliharaan udang Lampiran 3.

3.2.4.4 Kondisi Hewan Uji

Udang vaname diperoleh dari PT. Global Gen Indonesia, Labuan, Banten. Sebelum digunakan, udang vaname PL 41; bobot rataan 0,6 g diadaptasikan selama dua minggu dalam wadah fiber volume 1 ton. Udang diberi pakan sekenyangnya sebanyak lima kali sehari pada pukul 06.00, 10.00, 14.00, 18.00 dan 22.00 WIB. Setelah proses adaptasi, udang uji PL 55; bobot rataan 1,9 g kemudian dipindahkan ke dalam akuarium perlakuan sebanyak 40 ekor per akuarium. Udang diberi pakan perlakuan selama 30 hari dengan metode dan frekuensi pemberian pakan yang sama seperti saat adaptasi. Selain dengan menggunakan sistem resirkulasi, kualitas air media dipertahankan dengan aerasi terus menerus dan penyifonan setiap dua kali sehari pada pagi dan sore hari. Penyifonan juga dilakukan untuk mengambil sisa pakan untuk pengukuran parameter jumlah konsumsi pakan. Uji in vivo dikelompokkan menjadi dua yaitu uji resistensi udang vaname terhadap infeksi IMNV dan uji performa pertumbuhan. Setelah pemberian pakan perlakuan selama 30 hari, dilakukan analisis dan perhitungan parameter pertumbuhan untuk uji performa pertumbuhan serta pengukuran populasi bakteri usus. Setelah itu, sebanyak 18 ekor udang tiap akuarium dipelihara kembali untuk dilakukan uji resistensi terhadap IMNV. Infeksi IMNV dilakukan dengan menginjeksikan hasil ekstraksi tubuh udang yang positif terinfeksi berdasarkan pengamatan gejala klinis dan hasil analisis PCR. Sampel udang yang positif terinfeksi IMNV didapatkan dari Balai Pengembangan Budidaya Air Payau BPBAP Situbondo, Jawa Timur dan diekstrak berdasarkan Escobedo et al. 2006 Lampiran 4. Udang yang diinfeksi IMNV pada masing-masing akuarium, sebanyak 15 ekor digunakan untuk pengukuran parameter sintasan dan gejala klinis serta 3 ekor untuk pengukuran parameter imunitas. Selama waktu pengamatan, udang diberi pakan kontrol dengan metode dan frekuensi yang sama seperti saat perlakuan. Resirkulasi air, aerasi dan penyifonan tetap dilakukan untuk mempertahankan kualitas air. 15

3.2.4.5 Pengujian Resistensi Udang Vaname terhadap Infeksi IMNV

Uji ini dilakukan untuk mengevaluasi kinerja sinbiotik dalam meningkatkan resistensi udang vaname yang diinfeksi IMNV. Pengujian terdiri dari lima perlakuan dengan tiga ulangan, sebagai berikut: Kontrol - : Udang vaname diberi pakan komersil dan diinjeksi PBS. Kontrol + : Udang vaname diberi pakan komersil dan diinfeksi IMNV. Pro+Pre 1 : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 1 serta diinfeksi IMNV. Pro+Pre 2 : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 2 serta diinfeksi IMNV. Pro+Pre 3 : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 3 serta diinfeksi IMNV. Udang diberi pakan perlakuan setiap hari selama 30 hari. Infeksi IMNV dilakukan melalui injeksi sebanyak 0,1 ml per ekor udang. Pengamatan dilakukan selama 10 hari setelah infeksi. Parameter yang diamati meliputi sintasan SR dan gejala klinis yang diukur pada akhir pengamatan, serta parameter imunitas total hemosit dan aktivitas phenoloxidase pada awal hari ke 0 sebelum infeksi, tengah dan akhir pengamatan hari ke 5 dan ke 10 setelah infeksi. Tahapan dan waktu kegiatan uji resistensi udang vaname terhadap IMNV dijelaskan pada Lampiran 5. a. Pengambilan Sampel Hemolimph Hemolimph diambil dari ventral sinus pada pangkal kaki renang pertama dengan menggunakan syringe 1 ml yang telah dibilas dan diisi antikoagulan sebanyak 200 µl. Hemolimph yang terkumpul kemudian dimasukkan ke dalam eppendorf 2 ml dan dicatat volumenya sebagai faktor pengencer pada perhitungan nilai total hemosit dan aktivitas phenoloxidase. Untuk mengawetkan sampel hemolimph selama pengukuran parameter imunitas, sampel disimpan di dalam cool box yang telah diisi dengan batu es. b. Sintasan SR Sintasan udang dihitung dengan menggunakan rumus berikut: SR = Nt No x 100 Keterangan : Nt : Jumlah udang yang hidup pada akhir pengamatan ekor No : Jumlah udang pada awal pengamatan ekor c. Gejala Klinis Gejala klinis yang timbul pada udang dapat menunjukkan tingkat infeksi dari IMNV tersebut. Data gejala klinis yang dihasilkan berupa kualitatif deskriptif dan kemudian dibuat semi kuantitatif dengan cara skoring. 16 Pengelompokan gejala klinis ditentukan berdasarkan Hasan 2011 dengan sedikit modifikasi Tabel 4 dan Gambar 9 Tabel 4 Pengelompokan tingkat infeksi IMNV terhadap udang vaname berdasarkan gejala klinis yang muncul Level Gejala Klinis Tingkat Infeksi 1 Terinfeksi tanpa gejala klinis Ringan 2 Sedikit warna putih lebam di dalam jaringan di beberapa segmen abdomen Sedang 3 Sebagian besar jaringan abdomen berwarna putih lebam Berat 4 Bagian abdomen dari arah ekor berwarna merah jaringan mati Sangat berat Gambar 9 Gejala klinis udang yang terinfeksi IMNV. Angka menunjukkan tingkat infeksi ringan 1, sedang 2, berat 3, dan sangat berat 4 d. Total Hemosit Pengukuran total hemosit THC dilakukan berdasarkan metode Blaxhall dan Daishley 1973. Hemolimph sebanyak 0,1 ml yang sudah ditambahkan antikoagulan, dihitung dengan menggunakan hemasitometer pada mikroskop perbesaran 400 kali. Perhitungan nilai THC dijelaskan di Lampiran 6. 4 3 2 1 17 e. Aktivitas Phenoloxidase PO Pengukuran PO dilakukan berdasarkan Liu dan Chen 2004. Aktivitas PO diukur berdasarkan formasi dopachrome yang dihasilkan oleh L-DOPA. Hemolimph yang sudah dicampur dengan antikoagulan sebanyak 1 ml disentrifus 1.500 rpm; suhu 4 o C selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet disuspensikan kembali secara perlahan ke dalam 1 ml larutan cacodylate- citrate buffer , selanjutnya disentrifus kembali. Pelet diambil dan disuspensikan dalam 200 μl cacodylate-citrate buffer. Suspensi sel sebanyak 100 μl diinkubasi dengan 50 μl trypsin 1 mg ml -1 cacodylate-citrate buffer selama 10 menit pada suhu 25-26 o C. Selanjutnya ditambahkan 50 μl L-DOPA 3 mg ml -1 cacodylate- citrate buffer setelah 5 menit, dan ditambahkan 800 μl cacodylate-citrate buffer . Densitas optikal optical density diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Larutan standar mengandung 100 μl suspensi hemosit, 50 μl cacodylate-citrate buffer pengganti tripsin dan 50 μl L-DOPA yang digunakan untuk mengukur background aktivitas PO pada semua larutan uji. Aktivitas PO dihitung berdasarkan rumus berikut: � � � = � − � µ ℎ � ℎ µ ℎ � � ℎ+µ � � � �

3.2.4.6 Pengujian Performa Pertumbuhan

Penelitian ini dilakukan untuk menguji kinerja sinbiotik dengan berbagai dosis oligosakarida terhadap performa pertumbuhan udang vaname. Pengujian terdiri dari empat perlakuan dengan tiga ulangan sebagai berikut: Kontrol : Udang vaname diberi pakan komersil. Pro+Pre 1 : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 1. Pro+Pre 2 : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 2. Pro+Pre 3 : Udang vaname diberi pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 3. Udang diberi pakan perlakuan setiap hari selama 30 hari. Parameter yang diukur berupa penambahan bobot tubuh, jumlah konsumsi pakan, laju pertumbuhan spesifik, efisiensi pakan, retensi nutrien protein dan lemak serta aktivitas enzim pencernaan protease dan amilase. Parameter uji dihitung dengan menggunakan rumus seperti pada Tabel 5. Tahapan dan waktu kegiatan uji performa pertumbuhan dijelaskan pada Lampiran 5. Analisis proksimat dilakukan di Laboratorium Nutrisi, FPIK IPB dan analisis enzim di Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Antar Universitas PAU IPB. Prosedur analisis proksimat dan enzim dijelaskan di Lampiran 7 dan 8, serta hasil proksimat tubuh udang dan pakan perlakuan di Lampiran 9. 18 Tabel 5 Perhitungan parameter pengujian performa pertumbuhan: penambahan bobot tubuh ∆ Biomasa, jumlah konsumsi pakan JKP, laju pertumbuhan SGR, efisiensi pakan EP, retensi nutrien protein dan lemak, aktivitas enzim AE protease dan amilase Parameter Rumus perhitungan Pustaka ∆ Biomasa g � ℎ� − � - JKP g bobot pakan yang diberikan – bobot sisa pakan - SGR hari -1 [ � � � 1 − ] × Huisman 1987 EP ℎ � � ℎ � � Takeuchi 1988 Retensi nutrien [ � − � ⁄ ] × Takeuchi 1988 AE unit menit -1 ml -1 [ � − � � − � ] � −1 Bergmeyer dan Grassi 1983; Bernfeld 1955 Keterangan tabel: Wf = Bobot udang akhir Wi = Bobot udang awal t = Periode pemeliharaan F = Jumlah nutrien tubuh pada akhir pemeliharaan g I = Jumlah nutrien tubuh pada awal pemeliharaan g P = Jumlah nutrien pakan yang dikonsumsi g OD = Persen absorbansi P = Pengenceran T = Waktu menit

3.2.4.7 Populasi Bakteri Usus Udang

Pengukuran populasi bakteri usus udang dilakukan pada sebelum awal dan setelah 30 hari pemberian pakan perlakuan. Sampel udang untuk pengukuran populasi usus awal diambil dari wadah stok sebanyak lima ekor, sesaat sebelum udang dipindahkan ke akuarium perlakuan. Sedangkan sampel udang untuk pengukuran populasi usus setelah perlakuan diambil dari masing-masing akuarium sebanyak satu ekor dan digabungkan antar perlakuan yang sama. Pengambilan sampel udang dilakukan secara acak. Sampel udang yang telah diambil kemudian didesinfeksi dengan mencelupkan udang ke alkohol 70 untuk mengurangi kemungkinan kontaminasi pada usus. Usus udang perlakuan yang sama digabungkan dan dimasukkan ke dalam eppendorf yang sebelumnya telah diberi larutan PBS 500 µl. Sebelum dan sesudah diisi usus, eppendorf ditimbang untuk mengetahui bobot usus. Selanjutnya usus digerus sampai homogen dan kemudian 19 dihitung konsentrasi total bakterinya dengan metode total plate count pada media SWC agar.

3.2.4.8 Kualitas Air Media Pemeliharaan

Pengukuran kualitas air media pemeliharaan udang dilakukan tiga kali selama masa pemberian pakan perlakuan yaitu pada awal, tengah dan akhir perlakuan. Parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu o C, salinitas o oo , oksigen terlarut DO mg l -1 , TAN mg l -1 , dan pH. Pengukuran suhu, salinitas, DO dan pH dilakukan dengan menggunakan alat berupa termometer, refraktometer, DOmeter dan pHmeter. Pengukuran nilai TAN dilakukan di Laboratorium Pengujian Departemen Teknologi Industri Pertanian TIN IPB.

3.3 Prosedur Analisis Data

Uji resistensi udang vaname terhadap infeksi IMNV terdiri dari lima perlakuan dengan tiga ulangan, sedangkan uji performa pertumbuhan terdiri dari empat perlakuan dengan tiga ulangan. Kedua percobaan tersebut menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan satu faktor. Analisis data dilakukan dengan dua metode yaitu analisis ragam analysis of varianceANOVA pada selang kepercayaan 95 α=0,05 dan analisis deskriptif. ANOVA digunakan untuk analisis data sintasan, gejala klinis, total hemosit, aktivitas PO, dan data parameter pertumbuhan. Apabila terdapat perbedaan antar perlakuan maka analisis dilanjutkan dengan uji Tukey menggunakan software IBM SPPS Statistics version 19 . Sedangkan analisis desktiptif digunakan untuk data kandungan oligosakarida, pertumbuhan bakteri SKT-b, kombinasi sinbiotik optimal, populasi bakteri usus, aktivitas enzim dan data kualitas air. 20 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Kandungan Oligosakarida dalam Ubi Jalar dan Pakan Komersil

Ubi jalar memiliki kandungan karbohidrat tinggi ± 20, termasuk tanaman yang mudah dibudidayakan, produksi melimpah dan harganya yang relatif murah sehingga sangat potensial untuk dikembangkan. Ubi jalar diketahui memberikan manfaat bagi kesehatan karena mengandung oligosakarida tidak dapat dicerna non- digestible oligosaccharides [NDOs] yang berfungsi sebagai prebiotik, diantaranya rafinosa dan sukrosa Marlis 2008; Putra 2010; Haryati dan Supriyati 2010. Hasil penelitian menunjukkan konsentrasi oligosakarida dalam ekstrak etanol dari tepung kukus ubi jalar sebesar 64,86. Sukrosa merupakan jenis oligosakarida dengan persentase konsentrasi tertinggi 52,86 diikuti rafinosa dan maltoheptaosa masing-masing 8,14 dan 3,86. Kontras dengan komposisi oligosakarida pada ubi jalar, pakan udang komersial didominasi oleh maltoheptaosa sebesar 3,07 Tabel 6 dan Lampiran 10. Kandungan sukrosa dalam pakan udang sangat kecil serta tidak terdeteksi adanya rafinosa, sehingga perlu ditambahkan oligosakarida dari sumber lain sebagai prebiotik. Pengkayaan pakan dengan NDOs terbukti memperbaiki mikroekologi usus termasuk meningkatkan populasi bakeri, profil biokimia dan efek fisiologis Mussatto dan Mancilha 2007. Tabel 6 Jenis dan konsentrasi oligosakarida hasil ekstraksi dari tepung kukus ubi jalar dan pakan udang komersil dengan metode HPLC Jenis oligosakarida Konsentrasi oligosakarida hasil ekstraksi Ubi jalar Pakan udang komersil Maltoheptaosa 3,86 3,07 Rafinosa 8,14 - Sukrosa 52,86 0,91 Total oligosakarida 64,86 3,98 tidak terdeteksi

4.2 Pertumbuhan Bakteri Probiotik SKT-b

Bakteri yang ditumbuhkan di media akan mengalami empat fase pertumbuhan yaitu fase lamban, eksponensial, stasioner dan fase kematian. Biakan dengan inokulan berasal dari biakan bakteri segar umumnya tidak mengalami fase lamban, sehingga fase eksponensial terjadi mulai jam ke 0. Puncak pertumbuhan bakteri SKT-b terjadi pada jam ke 16 dan masuk fase kematian pada jam ke 18. Fase stasioner bakteri SKT-b diduga berada pada selang jam ke 16-18 Gambar 10. Konsentasi bakteri SKT-b pada puncak pertumbuhannya mencapai 5,9x10 10 cfu ml -1 Lampiran 11. 21 Gambar 10 Kurva pertumbuhan bakteri SKT-b yang dikultur di media SWC cair dan dihitung dengan metode total plate count

4.3 Kombinasi Sinbiotik Optimal

Oligosakarida yang berasal dari ubi jalar dapat dimanfaatkan sebagai sumber makanan oleh bakteri probiotik SKT-b untuk menunjang pertumbuhan bakteri tersebut secara in vitro. Penambahan oligosakarida ke media kultur meningkatkan pertumbuhan bakteri SKT-b, yang berkorelasi positif terhadap peningkatan dosis prebiotik tersebut, pada semua perlakuan konsentrasi bakteri. Jumlah inokulan yang ditambahkan ke media kultur juga menentukan konsentrasi akhir dari biakan bakteri yang dikultur. Pengurangan jumlah inokulan bakteri SKT-b menyebabkan penurunan konsentrasi akhir biakan pada semua perlakuan dosis prebiotik. Kombinasi prebiotik dan probiotik yang optimal didapatkan pada penambahan prebiotik 3 dan inokulan bakteri SKT-b konsentrasi 10 10 cfu ml -1 Gambar 11. Li et al. 2009 menyebutkan bahwa ada hubungan yang erat antara efek dosis probiotik dan prebiotik terhadap efisiensinya. Oligosakarida dalam jumlah tertentu bersifat antinutrisi. Pemberian karbohidrat yang berasal dari bungkil kedelai kandungan total karbohidrat terlarut 12-15, dengan kandungan oligosakarida utama yaitu sukrosa 6-7, rafinosa 1-2 dan stakiosa 5-6, menurunkan konsumsi pakan pada hybrid striped bass dan rainbow trout, serta menurunkan kecernaan pakan pada trout Francis et al. 2001. Selain itu, dosis prebiotik yang diaplikasikan dalam kegiatan budidaya berkolerasi positif dengan biaya produksi. Oleh karena itu perlu dievaluasi efek dosis prebiotik tersebut secara in vivo. Diharapkan diperoleh dosis prebiotik terkecil yang memberikan dampak tidak berbeda dengan dosis yang lebih tinggi terhadap penanggulangan infeksi IMNV maupun performa pertumbuhan udang vaname. 5.68 10.77 8.50 5 6 7 8 9 10 11 12 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 K on se nt ra si s el b ak te ri S K T -b lo g cf u m l -1 Jam ke 22 Gambar 11 Nilai absorbansi biakan perlakuan kombinasi bakteri SKT-b konsentrasi 10 7 , 10 8 , 10 9 dan 10 10 cfu ml -1 dengan prebiotik dosis 0 kontrol , 1 , 2 dan 3

4.4 Uji In Vivo

4.4.1 Populasi Bakteri Usus Udang

Secara in vivo, pemberian oligosakarida selama 30 hari terbukti meningkatkan populasi bakteri di dalam usus udang vaname. Peningkatan yang signifikan ditunjukkan oleh udang yang diberi perlakuan Pro+Pre 2 dan Pro+Pre 3 masing-masing sebesar 2,03 x 10 8 dan 1,25 x 10 8 cfu g usus -1 atau mencapai 10,9 dan 6,7 kali lebih tinggi dibandingkan Kontrol Gambar 12. Rafinosa diketahui mampu meningkatkan jumlah mikroflora spesifik dalam usus Mathious et al . 2006; Haryati dan Supriyati 2010. Namun efek dari peningkatan populasi mikroflora terhadap inang karena pemberian ekstrak oligosakarida dari ubi jalar, perlu dipelajari lebih lanjut. Mekanisme kerja dari berbagai jenis prebiotik tidak selalu sama. Beberapa prebiotik menyebabkan peningkatan mikroflora spesifik asli usus pencernaan yang menyebabkan menurunnya bakteri patogen di usus melalui kompetisi langsung terhadap nutrien atau binding site dengan memproduksi blocking factors . Beberapa prebiotik bekerja dengan cara menurunkan pH usus karena dihasilkannya short-cain fatty acid SCFA, yang mengakibatkan persentase bakteri menguntungkan meningkat dan menurunkan persentase bakteri merugikan. Mannanoligosaccharides MOS sebagai prebiotik mempunyai mekanisme berbeda yang secara selektif tidak menyebabkan peningkatan populasi bakteri 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1010 109 108 107 A bs or ba ns i µ m Konsentrasi inokulan bakteri SKT-b cfu ml -1