3. METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret sd Juni 2009. Tempat penelitian di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, Laboratorium Pengolahan,
Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Laboratorium Mikroteknik dan Laboratorium Anatomi Tumbuhan, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Laboratorium Biologi Hewan, Laboratorium SEAFAST Pusat Antar Universitas PAU, Institut
Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang dibutuhkan dalam proses pengukuran adalah penggaris stainless merk Kenko, kaca pembesar, dan jangka sorong. Pembuatan preparat digunakan
alat gelas penyimpan sampel, meja cetak, karton cetak, oven, mikrotom Yamoto RV-240, meja pemanas, gelas obyek, dan rak pewarna. Sedangkan untuk proses
pengamatan digunakan mikroskop cahaya merk Olympus CH2O dan kamera mikroskop merk Olympus DP12. Analisis proksimat digunakan alat: cawan, oven,
desikator, tanur, labu-kjeldahl, erlenmeyer, dan alat ekstraksi soxhlet. Sedangkan pada uji vitamin digunakan tabung reaksi, becker glass, mortar, erlenmeyer,
HPLC simadzu lc 9A dan labu ukur. Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain, daun dan tangkai
semanggi air Marsilea crenata presl yang berasal dari Surabaya, dan bahan- bahan untuk penghitungan proksimat meliputi, larutan K
2
SO
4
, H
2
SO
4
, NaOH- Na
2
S
2
O
3
, H
3
BO
3
, asam klorida, larutan indikator, pelarut etil eter. Dalam pembuatan preparat bahan yang dibutuhkan meliputi, safranin, larutan FAA,
Etanol absolut, TBA, minyak parafin, parafin, Xilol, Etanol 95 , Etanol 70 , Etanol 50 , Etanol 30 , Akuades, Safranin 2 , Fast-green 0,5 . Untuk uji
vitamin bahan yang dibutuhkan antara lain, hexan : aceton 1:1, KOH dalam methanol 5, hexan aceton, aquades, gas N
2
dan Na
2
SO
4,
oksalat kristal, air suling.
3.3 Metodologi Penelitian
Penelitian ini terbagi menjadi dua tahap yaitu penelitian pendahuluan yang meliputi penghitungan ukuran tumbuhan antara lain panjang, lebar, dan tebal
daun, serta panjang dan tebal tangkai. Penelitian utama meliputi analisis histologi, uji kandungan gizi, dan uji vitamin daun semanggi air Marsilea crenata Presl.
3.3.1 Penelitian pendahuluan Penelitian ini diawali dengan pengidentifikasian tanaman semanggi air
yang dilakukan di laboratorium Identifikasi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Cibinong, Bogor. Tanaman semanggi air yang didatangkan dari
Surabaya yang tumbuh di persawahan dengan cara diambil dengan media tumbuhnya yaitu tanah dan sedikit air lalu dimasukkan ke dalam kantong plastik
agar sampel tidak mudah layu. Ketika sampai di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan,
Departemen Teknologi Hasil Perairan, IPB diukur panjang, dan lebar daun serta panjang dan tebal tangkai. Pengukuran panjang dan lebar daun, serta panjang
tangkai dilakukan dengan penggaris stainless merk kenko. Pengukuran tebal tangkai menggunakan jangka sorong merk NSK. Setelah pengukuran selesai,
tanaman semanggi air dibagi dua untuk analisis histologi dan uji proksimat serta vitamin. Untuk pengujian dilakukan preparasi berupa pembuangan batang dan
akar yang diambil tangkai dan daunnya untuk dilakukan uji baik dalam keadaan segar maupun dikukus.
3.3.2 Penelitian utama Penelitian utama tanaman semanggi terdiri dari lima tahap, yaitu analisis
histologi, analisis proksimat serta analisis vitamin semanggi air segar dan kukus. Kerangka penelitian dapat dilihat pada Gambar 13.
Gambar 13. Kerangka penelitian utama
3.3.2.1 Analisis Histologi Johansen 1940 Analisis ini diawali dengan pembuatan preparat semanggi Marsilea
crenata dan pengambilan foto objek pada mikroskop cahaya Olympus CH2O.
Pembuatan preparat sendiri dimulai dengan fiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA, setelah itu larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan etanol 50 sebanyak
4 kali dengan waktu penggantian masing-masing selama 1 jam. Dehidrasi dan penjernihan dilakukan secara bertahap melalui perendaman dalam larutan seri
Johansen I-VII. Proses infiltrasi dilakukan dengan cara bahan dimasukkan dalam wadah
berisi campuran TBA, minyak parafin, serta 13 parafin beku dan disimpan pada suhu kamar selama 1-4 jam yang dilanjutkan pengovenan pada suhu 58
o
C selama 12 jam. Pergantian parafin dilakukan setiap 6 jam sekali sebanyak 3 kali
pergantian. Proses penanaman dilakukan dengan penggantian parafin dan disimpan pada suhu ruang. Setelah proses penanaman selesai, dilakukan
penyayatan dengan mikrotom Yamoto RV-240 putar setebal 10 μm. Hasil sayatan
kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi albumin-gliserin dan Semanggi air Marsilea crenata presl
Pengukuran
Preparasi Pembuangan batang dan akar
Analisis Histologi
Daun dan tangkai semanggi
Analisis Proksimat Analisis Vitamin
Pengukusan
Analisis Vitamin Analisis Proksimat
Semanggi air Marsilea crenata presl
Preparasi Pembuangan batang dan akar
Analisis Histologi Pengukuran
Daun dan tangkai semanggi
Analisis Proksimat Pengukusan
Analisis Vitamin
Analisis Proksimat Analisis Vitamin
ditetesi air. Gelas berisi pita parafin kemudian dipanaskan pada hot-plate dengan suhu 45
o
C selama 3-5 jam. Langkah selanjutnya adalah pewarnaan yang mana dilakukan dengan
safranin 2 dalam air dan fastgreen 0,5 dalam etanol 95 . Pada proses pewarnaan, gelas obyek direndam ke dalam larutan xilol 1 dan xilol 2 masing-
masing selama 20 menit, dilanjutkan perendaman dalam etanol absolut 95 , 70 , 50 , dan 30 masing-masing 5 menit. Kemudian obyek dibilas dengan
akuades dan dimasukkan ke dalam safranin 20 selama satu hari. Tahap selanjutnya adalah gelas obyek dibilas ke dalam akuades dan dimasukkan ke
etanol 30 , 50 , 70 , 95 , dan absolut masing-masing selama 5 menit. Setelah itu obyek dimasukkan ke dalam pewarna fast-green 0,5 selama 30
menit. Gelas obyek kemudian direndam dalam xilol 1 dan xilol 2. Penutupan dengan pemberian entellan atau Canada balsam setelah proses
pewarnaan selesai dilakukan pada gelas obyek dan ditutup dengan gelas penutup. Setelah itu dilakukan pemberian label di sebelah kiri gelas obyek. Proses
pemfotoan objek dilakukan dengan mikroskop cahaya merk Olympus DP12 dan kamera digital merk Olympus. Prosedur pembuatan preparat dapat dilihat pada
Gambar 14.
Gambar 14. Proses pembuatan preparat
3.3.2.2 Analisis Proksimat Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk
mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat meliputi: analisis kadar air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat. Analisis
proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan uji kadar abu menggunakan metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet dan uji kadar protein
mengggunakan metode kjeldahl serta uji kadar serat kasar. a. Analisis kadar air AOAC 1995
Prinsip dari analisis kadar air yaitu mengetahui kandungan atau jumlah kadar air yang terdapat pada suatu bahan. Tahapan analisis kadar air antara lain:
pengeringan dimana cawan porselen di simpan dalam oven pada suhu 102-105 C.
Selanjutnya cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator kurang lebih 30 menit dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang hingga beratnya konstan.
Setelah itu cawan dan daun semanggi seberat 5 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dipotong kecil-kecil. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam oven dengan
Fiksasi Pencucian
Dehidrasi dan Penjernihan Infiltrasi
Penanaman Penyayatan
Perekatan Pewarnaan
Penutupan dan Pemberian Label Preparat
Pemfotoan
suhu 102-105 C selama 3-5 jam kemudian dimasukkan ke dalam desikator dan
dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air pada daun semanggi :
Kadar air = B - C x 100 B – A
Keterangan : A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan daun semanggi gram
C = Berat cawan dengan daun semanggi setelah dikeringkan gram.
b. Analisis kadar abu AOAC 1995 Prinsip dari analisis kadar abu yaitu untuk mengetahui jumlah abu yang
terdapat pada suatu bahan terkait dengan mineral dari bahan yang dianalisis.
Tahapan pada analisis kadar abu yaitu cawan abu porselen dipijarkan dalam
tungku pengabuan bersuhu sekitar 650 C selama 1 jam. Cawan abu porselen
tersebut didinginkan selama 30 menit. Setelah suhu tungku turun dilakukan penimbangan. Daun semanggi sebanyak 1-2 gram yang telah dipotong kecil-kecil
dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam tungku secara bertahap hingga suhu 650
C. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah suhu tungku pengabuan turun menjadi sekitar 200
C,
cawan abu porselin didinginkan selama 30 menit dan ditimbang beratnya.
Perhitungan kadar abu pada daun semanggi :
Kadar abu = C - A x 100 B – A
Keterangan : A = Berat cawan abu porselen kosong gram B = Berat cawan abu porselen dengan daun semanggi
gram C = Berat cawan abu porselen dengan daun semanggi
setelah dikeringkan gram.
c. Analisis kadar protein AOAC 1995 Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein
kasar crude protein pada suatu bahan. Tahapan yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.
1. Tahap destruksi Tahap destruksi dilakukan dengan cara daun semanggi air ditimbang seberat
0,5 gram dan dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H
2
SO
4.
Tabung yang berisi larutan 10 ml H
2
SO
4
ini dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410
o
C dan ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi
bening. 2. Tahap destilasi
Tahap ini dilakukan setelah tahap destruksi selesai dilakukan. Tahap destilasi sendiri terdiri dari 2 tahap, yaitu persiapan dan sampel. Tahap persiapan
dilakukan dengan membuka kran air dan dilakukan pengecekan alkali serta air dalam tanki, tabung dan erlenmeyer berisi akuades kemudian diletakkan pada
tempatnya. Tombol power pada kjeltec sistem ditekan lalu dilanjutkan dengan menekan tombol steam dan tungku beberapa lama sampai air di dalam tabung
mendidih. Setelah itu steam dimatikan, tabung kjeltec dan erlenmeyer dikeluarkan dari alat kjeltec sistem. Tahap sampel dilakukan dengan meletakkan tabung yang
berisi daun semanggi air yang sudah didestruksi ke dalam kjeltec sistem beserta erlenmeyer yang diberi asam borat. Destilasi dilakukan sampai volume larutan
dalam erlenmeyer yang berisi asam borat mencapai 200 ml. 3. Tahap titrasi
Titrasi merupakan tahap terakhir pada analisis kadar protein. Tahap ini dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan pada erlenmeyer
berubah warna menjadi pink. Perhitungan kadar protein pada daun semanggi :
Nitrogen = ml HCl daun semanggi – ml HCl blankox 0,1 N HClx14 x100 mg daun semanggi
Kadar Protein = Nitrogen x faktor konversi
d. Analisis kadar lemak AOAC 1995 Tahapan analisis kadar lemak antara lain yaitu daun semanggi air seberat 3
gram W
1
dimasukkan ke dalam kertas saring. Kertas saring tersebut dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang
sudah ditimbang berat tetapnya W
2
dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak tersebut dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet
dan disiram dengan pelarut lemak. Saat itu juga tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40
C dengan menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak
didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan ditampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke
dalam labu lemak lalu labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 C,
setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan W
3
. Perhitungan kadar lemak pada daun semanggi
Kadar Lemak = W
3
– W
2
x 100 W
1
Keterangan : W
1
= Berat sampel daun semanggi gram W
2
= Berat labu lemak tanpa lemak gram W
3
= Berat labu lemak dengan lemak gram e Analisis Kadar Serat Kasar AOAC 1995
Metode analisis kadar serat kasar yaitu sebanyak 1 gram sampel kering dilarutkan dengan 100 ml H
2
SO
4
1,25 dan dipanaskan hingga mendidih kemudian didestruksi selama 30 menit. Tahap selanjutnya adalah disaring
menggunakan kertas saring Whatman ф:10 cm dan dengan bantuan corong
Buchner. Residu hasil saringan dibilas dengan 20-30 ml air mendidih dan 25 ml air sebanyak 3 kali. Residu didekstrusi kembali dengan 100 ml NAOH 1,25
selama 30 menit. Setelah itu disaring dengan cara seperti diatas dan dibilas berturut-turut dengan 25 ml H
2
SO
4
1,25 , 2,5 ml air sebanyak 3 kali, dan 25 ml alkohol. Residu beserta kertas saring dipindahkan ke cawan porselin dan
dikeringkan dalam oven 130
o
C selama 2 jam. Setelah dingin residu beserta cawan
porselin ditimbang A, dan dimasukkan dalam tanur 600
o
C selama 30 menit, lalu didinginkan dan ditimbang kembali B.
Penghitungan kadar serat kasar pada daun semanggi
Kadar serat kasar = bobot serat kasar x 100 bobot sampel kering
3.3.2.3 Analisis Vitamin Analisis vitamin yang dilakukan meliputi uji kadar
β karoten, vitamin C, dan total karoten, dari semanggi segar dan semanggi yang dikukus.
a Analisis vitamin C Darryl M et al 1993
Metode penetapan vitamin C dengan titrameter. Prinsip penetapan vitamin C yaitu melalui proses titrasi, larutan garam natrium dari 2,6 dichlorophenol
indophenols larutan dye akan mengoksidasi vitamin C menjadi asam dehidroaskorbat. Sedangkan larutan dye menyebabkan larutan titrasi berwarna
merah. Titik akhir titrasi tercapai bila membentuk warna jambu muda yang stabil selama 15 detik. Kadar vitamin C dihitung dengan membandingkan volume
larutan dye yang diperlukan untuk titrasi contoh bahan terhadap volume larutan dye
yang diperlukan untuk titrasi larutan standar. 1 Pembuatan larutan contoh
Sampel ditimbang 10 g dan digerus dengan 10 g asam oksalat kristal di dalam mortar dengan alat penggerus. Kemudian campuran bahan dimasukan ke
dalam labu ukur 250 ml, labu ukur diisi dengan air suling dan dikocok dan ditambahkan air suling hingga tanda tera. Setelah itu filtratnya disaring dan
ditampung dalam Erlenmeyer bersih dan kering. Lalu dipipet 10 ml dan dimasukan ke dalam erlenmeyer 50 ml untuk ditritasi dengan larutan dye sampai
warna merah jambu muda selama 15 detik. 2
Pembuatan larutan vitamin C Vitamin C murni ditimbang 0,02 g dan ditambah asam oksalat kristal.
Kemudian dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml dan diencerkan dengan air suling sampai tanda tera. Lalu dipipet 10 ml dan dimasukan ke dalam erlenmeyer
50 ml untuk ditritasi dengan larutan dye sampai warna merah jambu muda. Setelah itu ditunggu selama 15 detik samapi warna tidak berubah.
3 Perhitungan
Vitamin C dalam mg per 100 g bahan = 100 x fp x v x E A
Keterangan : A = berat bahan g
Fp = factor pengenceran
V = ml larutan dye yang digunakan
E = akivalen vitamin C
b Analisis β karoten Darryl M et al 1993
Analisis β karoten menggunakan beberapa pereaksi, yaitu: hexan : aceton
1:1, KOH dalam methanol 5 , hexan aceton, aquades, gas N
2
dan Na
2
SO
4.
1 Ekstraksi
Sampel kering yang sudah dihomogenisasikan ditimbang 2-5 gram, ditambah larutan hexan aceton, 3 x 10 ml lalu divortek selama 30 detik. Larutan
pengekstrak dikoleksi dalam tabung reaksi gelap dan tertutup kemudian ditambah aquades 5 ml dan divortek kembali 30 detik sampai terpisah. Lapisan atas
dipisahkan dan pelarutnya diuapkan dengan gas N
2.
2 Saponifikasi
Setelah semua pelarutnya hilang ditambahkan 15 ml KOH dalam methanol, head space dalam tabung diisi dengan gas N
2
untuk menghindari oksidasi oleh O
2
dan ditutup rapat. Kemudian dipanaskan dalam water bath 65 C
selama 30 menit dan didinginkan dengan air mengalir. 3
Pengekstrakan kembali Selanjutnya adalah penambahan air ke dalam tabung yang telah
didinginkan sebanyak 5 ml, divortek 30 detik dan dicuci dengan hexan 3 x 15 ml. Hexan yang telah dikoleksi dicuci dengan air 3 x 3 ml lalu hexan disaring dengan
Na
2
SO
4
dan diuapkan dengan gas N
2
serta dilarutkan dengan fase gerak HPLC. Ekstrak yang berisi
β karoten dapat dianalisis menggunakan HPLC. Sistem yang dianjurkan adalah sebagai berikut:
Fase gerak : acetonitril : diclorometan : metanol 70:20:10
Kolom : reverse phase C18
Kecepatan aliran : 1 mlmenit
Detektor : UV visible 460 nm
Rekorder : 1 cmmenit
b Total karoten Darryl M et al 1993
Sampel kering yang sudah dihomogenisasikan ditimbang 2-5 gram, ditambah larutan hexan aceton, 3 x 10 ml lalu divortek selama 30 detik. Larutan
pengekstrak dikoleksi dalam tabung reaksi gelap dan tertutup kemudian ditambah aquades 5 ml dan divortek kembali 30 detik sampai terpisah. Lapisan atas
dipisahkan dan pelarutnya diuapkan dengan gas N
2
serta dilarutkan dengan fase gerak HPLC.
Ekstrak yang berisi total karoten dapat dianalisis menggunakan HPLC. Sistem yang dianjurkan adalah sebagai berikut:
Fase gerak : acetonitril : diclorometan : metanol 70:20:10
Kolom : reverse phase C18
Kecepatan aliran : 1 mlmenit
Detektor : UV visible 460 nm
Rekorder : 1 cmmenit
4. HASIL DAN PEMBAHASAN