Media PDA Potato Dextrose Agar dan PDB Potato Dextrose Broth

Lampiran 4 Pembuatan media isolasi, seleksi dan penyegaran isolat 1. Media YMEA Yeast Malt Extract Agar dan YGCA Yeast Glucose Chloramfenicol Agar Media YMEA digunakan untuk isolasi khamir pada buah-buahan, tetapi media ini tidak terlalu selektif, karena kapang atau bakteri masih bisa tumbuh. Oleh karena itu sebagai selekasi awal digunakan media YGCA yang diperkaya tetrasiklin untuk menghambat pertumbuhan kapang dan bakteri. Penambahan tetrasiklin dilakukan setelah sterilisasi media agar-agar. Komposisi kedua media tertera pada tabel berikut: Media Bahan Komposisi gl YMEA Agar ekstrak malt 5 Agar ekstrak khamir 23 YGC Glukosa 20 Ekstrak khamir 5 Kloramfenikol 0,1 Agar 150 Tetrasiklin 0,05

2. Media PDA Potato Dextrose Agar dan PDB Potato Dextrose Broth

Media PDA digunakan untuk penyegaran isolat khamir yang diperoleh dan sebagai media kultur stok, sedangkan PDB digunakan untuk menumbuhkan kultur kerja starter sebelum fermentasi. Komposisi media tertera pada tabel berikut: Media Bahan Komposisi gl PDA PDB 24 Agar 20 Kloramfenikol 0,1 Lampiran 5 Data isolat, sumber, ciri koloni dan konsumsi substrat selama fermentasi menggunakan media campuran glukosa-xilosa 1:1 murni pada tabung reaksi berulir Kode isolat Sumber Ciri-ciri koloni Penggunaan substrat ATCC S. cereviciae ATCC Kekuningan, berair 36.2 Ellipsoides S. ellipsoides Kekuningan, berair 35.8 AB Apel Putih keruh, lebar 11.4 K Apel Putih, lebar, tanpa inti 41.4 MP Melon Putih kekuningan, berair 35.5 O Melon Putih kekuningan, berair 26.1 P Melon Putih lebar, berserabut 30.0 D Nenas Bintik kecil, kekuningan 14.7 E Pepaya Bintik kecil, putih 31.4 G Pepaya Putih, lebar 40.0 H Pepaya Putih, bintik kecil 42.0 SB Semangka Putih lebar, dikelilingi koloni 64.1 T Semangka Putih lebar, bertumpuk 31.4 R Semangka Putih lebar, keruh 28.0 ABSTRACT EKA YULIANA. Bioethanol Production from Sago Pith using Enzymes and Yeast from Local Isolates. Under the direction of ANJA MERYANDINI and TITI CANDRA SUNARTI. Starch and fiber from Sago palm can be used for making bioethanol. Starch are accumulate in the pith core of sago palm steam. The pith was pretreated with conventional heating autoclaving or microwave. After pretreatment, the sago pith was hydroly sed using α-amylase at 95 o C. The saccharification of sago pith was conducted using consortia of three enzymes amyloglucosidase, cellulase and xylanase at 60 o C. Hydrolysis of sago pith was done with these commercial starch degradating enzymes and self-prepared enzymes from local isolates of cellulolytic and xylanolytic bacteria. Yeast used at the fermentation process was isolated from rotten fruits. Selection of yeast was based on their ability to consume mixed substrates of xylose and glucose; and the ethanol production. After 72 hours of fermentation the ethanol production was analyzed using Gas Chromatography. Ethanol produced from conventional heating was greater than microwave heating by using yeast isolate MP 8.11. Keywords : bioethanol, sago pith, enzymatic hydrolysis, local isolates PENDAHULUAN Latar Belakang Saat ini produksi bahan bakar fosil semakin menurun karena sumbernya yang semakin menipis di lapisan bumi, sedangkan kebutuhan energi dunia termasuk Indonesia semakin hari semakin meningkat namun tidak disertai dengan produksi energi yang memadai. Oleh sebab itu perlu dikembangkan suatu energi alternatif. Salah satunya adalah bioetanol dari biomassa yang mengandung pati dan lignoselulosa. Meskipun konversi material berpati dan lignoselulosa sudah banyak diteliti, namun terdapat kendala akibat tingginya biaya enzim dan besarnya energi yang dibutuhkan untuk proses. Oleh karena itu pemilihan proses yang efisien dan biaya rendah untuk konversi biomassa menjadi etanol sangat penting agar dapat meningkatkan pemanfaatan biomassa sebagai substitusi bahan bakar fosil. Sagu Metroxylon sp. merupakan tanaman yang ideal untuk bahan baku pemanis berbasis pati dan bahan baku etanol. Pengembangan agroindustri berbasis sagu akan memberi keuntungan secara ekonomi dan sosial pada daerah tertinggal di Indonesia bagian timur. Beberapa hasil penelitian juga telah mengkonversi pati dan bahan lignoselulosik menjadi sirup glukosa dan dilanjutkan menjadi etanol. Proses konversi pati atau bahan lignoselulolitik meliputi hidrolisis pati, selulosa, dan hemiselulosa menjadi gula-gula sederhana, kemudian fermentasi gula menjadi etanol oleh khamir dan bakteri. Penggunaan khamir lebih disukai dari pada bakteri karena ukuran sel yang besar dan dinding sel yang padat sehingga memudahkan pemanenan dan daur ulang proses. Selain itu khamir tidak mudah terkontaminasi oleh bakteri dan virus. Secara kuantitatif rendemen alkohol dari heksosa dalam fermentasi menggunakan khamir pada kondisi optimal dapat mencapai 90 Boyles 1984. Proses hidrolisis dapat dilakukan dengan hidrolisis enzimatis. Hidrolisis pati dikatalisis oleh enzim amilolitik. Hidrolisis selulosa dan hemiselulosa dikatalisis oleh enzim selulolitik dan xilanolitik. Pada proses hidrolisis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi seperti jenis substrat, aktivitas enzim, dan kondisi reaksi. Pati dalam bentuk tergelatinisasi sangat mudah terdegradasi, namun bahan lignoselulosik harus diberi perlakuan pendahuluan untuk menurunkan lignin, menurunkan kristalinitas selulosa, meningkatkan porositas dan luas permukaan bahan. Pemanasan dengan microwave dapat digunakan secara langsung untuk konversi biomassa berpati menjadi etanol, sementara lignoselulosa mengalami pre-treatment. Rendahnya waktu kontak dan konsumsi energi pada saat operasi microwave, akan menurunkan pembentukan produk sekunder yang tidak diinginkan. Pemanasan dengan microwave dapat mengkonversi langsung pati menjadi gula dalam waktu yang relatif rendah. Dibandingkan dengan pemanasan konvensional, laju reaksi hidrolisis pati menjadi glukosa meningkat 100 kali dengan penggunaan iradiasi microwave Kunlan et al. 2001. Lebih lanjut, Nikolic et al. 2008 juga menyatakan bahwa microwave treatment dalam durasi yang singkat dapat menghancurkan susunan struktur kristalin pati. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk memanfaatkan bakteri dan khamir isolat lokal dalam memperbaiki proses sakarifikasi pati dan serat sagu secara langsung dari empulur sagu menggunakan proses enzimatis, untuk menghasilkan gula-gula sederhana dalam produksi bioetanol. Tujuan khusus 1. Mengisolasi dan seleksi khamir isolat unggul yang akan digunakan untuk produksi bioetanol. 2. Mengkaji proses produksi gula sederhana yang efisien melalui penggunaan empulur sagu dalam proses enzimatis. 3. Meningkatkan perolehan gula sederhana melalui perlakuan awal biomassa pati dan serat menggunakan perlakuan microwave. 4. Meningkatkan perolehan gula sederhana melalui penggunaan enzim amilolitik, selulolitik dan xilanolitik secara simultan. 5. Produksi etanol dari hidrolisat empulur sagu menggunakan khamir varietas unggul. TINJAUAN PUSTAKA Empulur Sagu Tanaman sagu termasuk tumbuhan monokotil dari famili Palmae, sub famili Calamoideae, genus Metroxylon, spesies Eumetroxylon. Tanaman ini banyak ditemukan di hutan hujan dan toleran terhadap pH tanah yang asam dan mengandung unsur Al, Fe dan Mn yang tinggi. Fase vegetatif tanaman ini berada pada 7-15 tahun setelah penanaman dan selama masa inilah pati diakumulasi pada batang. Pati sagu akan maksimum pada saat sebelum tahap berbuah 10-13 tahun setelah penanaman. Ukuran dari batang sagu dan kandungan patinya bergantung pada jenis sagu, umur dan habitat pertumbuhannya. Sagu Metroxylon sp. dikenal sebagai tanaman penghasil karbohidrat. Sebagai sumber karbohidrat, tanaman sagu memiliki keunggulan dibandingkan dengan tanaman penghasil karbohidrat lain karena relatif sudah tersedia lahan yang telah ditanami sehingga dapat langsung dimanfaatkan, berkembang biak dengan anakan sehingga panen dapat berkelanjutan tanpa melakukan peremajaan ataupun penanaman ulang, dapat dipanen dan diolah tanpa musim, resiko terkena hama penyakit tanaman kecil, dan tingkat pemanfaatannya masih sedikit Bustaman 2008. Areal sagu Indonesia sangat luas yaitu sekitar 1,128 juta ha Bustaman 2008. Setiap satu batang pohon sagu rata-rata mengandung 200-400 kg pati sagu Safitri et al. 2009. Pati sagu diisolasi dari batang sagu. Batang sagu bagian dalam disebut empulur. Pada saat ekstraksi, empulur sagu yang digunakan harus segar dan segera diproses, karena jika ditunda akan mengakibatkan pati menjadi kecoklatan akibat aktivitas enzim katalisis reaksi oksidasi senyawa polifenol menjadi kuinon Onsa et al. 2000. Empulur sagu kering didominasi pati 81.51-84.72 dan serat 3.20- 4.20. Bagian tengah batang sagu mengandung pati lebih tinggi dibandingkan bagian luar Tabel 1. Batang sagu yang diekstraksi patinya akan menyisakan ampas sebagai limbah. Konversi langsung empulur sagu menjadi glukosa akan menghemat penggunaan air dan energi untuk ekstraksi dan pengeringan pati, sekaligus sebagai salah satu cara pemanfaatan limbah. Tabel 1. Komposisi empulur sagu kering Empulur Utuh Bagian Luar Bagian Tengah Bagian dalam Pati 83.50 81.51 83.20 84.72 Lemak Kasar 0.38 0.49 0.38 0.31 Serat Kasar 3.32 4.20 3.33 3.20 Abu 3.80 4.00 3.50 3.20 Protein 1.15 1.76 1.27 1.06 Pentosan 2.87 Asam organik sebagai asam malat 1.02 Air 9.79 12.03 12.74 12.67 Sumber : Fujii et al. 1986, data dalam basis kering, kecuali kadar air Pati Pati sagu umumnya berwarna putih, bersifat tidak larut dalam air, tidak berasa dan tidak berbau. Granula pati sagu berbentuk elips agak terpotong, permukaannya datar, dan berukuran 15-65 m. Granula pati terdiri atas bagian kristalin yang dibentuk oleh amilopektin dan amilosa, serta daerah amorf yang mengandung titik percabangan dari amilopektin Zhang et al. 2006, yang ditunjukkan oleh Gambar 1. Gambar 1 Struktur granula pati Pati mengandung dua komponen utama yaitu 20-30 amilosa dan 70- 80 amilopektin, yang keduanya merupakan polimer dengan konformasi glukosa pada 4 C 1 . Pati merupakan homopolimer glukosa dengan ikatan α-glikosidik. Pati terdiri atas dua fraksi yang dapat dipisahkan dengan air panas, fraksi terlarut disebut amilosa dan fraksi tidak terlarut disebut amilopektin. Tabel 2 berikut adalah karakteristik dari amilosa dan amilopektin. Daerah kristalin Daerah amorf Tabel 2 Karakteristik amilosa dan amilopektin Karakteristik Amilosa Amilopektin Struktur dasar Linear Bercabang Stabilitas dalam larutan Retrodegradasi Stabil Derajat polimerisasi 10 10 3 4 -10 Panjang rantai rata-rata 5 10 20-25 3 Hidrolisis oleh β-amilase 87 54 maks 650 nm kompleks iodin 550 nm Sumber: Aiyer 2005 Amilosa mempunyai struktur lurus dengan ikatan α-1,4-D-glikosidik sedangkan amilopektin mempunyai struktur bercabang dengan ikatan α -1,6-D- glikosidik sebanyak 4-5 dari berat total Winarno 1995. Struktur kimia amilosa dan amilopektin dapat dilihat pada Gambar 2. Gambar 2 Struktur amilosa dan amilopektin Mutu pati sagu ditentukan oleh ukuran, bentuk, aroma, rasa dan faktor lainnya. Pati sagu yang diperdagangkan harus memenuhi standar mutu yang telah ditetapkan. Badan Standarisasi Nasional mengeluarkan Standar Nasional Indonesia untuk mutu pati sagu yang dapat dilihat pada Tabel 3 berikut. Glukopiranos a Amilosa Amilopektin Tabel 3 Standar mutu pati sagu SNI 01-3729-1995 Karakteristik Kriteria Kadar air bb Maks. 13 Kadar abu bb Maks. 0.5 Kadar serat kasar bb Maks. 0.11 Derajat asam ml NaOH 1N100g Maks. 4 Kadar SO 2 Maks. 30 mgkg Kehalusan lolos ayakan 100 mesh bb Min. 95 Total Plate Count kolonig Maks. 10 Jenis pati lain selain pati sagu 6 Tidak boleh ada Sumber: Dewan Standarisasi Nasional 1995 Lignoselulosa Komponen lain dari empulur sagu yaitu serat selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Selulosa merupakan polimer glukosa yang membentuk rantai linier dan dihubungkan oleh ikatan β-1,4-glikosidik. Struktur linier ini menyebabkan selulosa bersifat kristalin. Molekul-molekul selulosa memiliki kecenderungan membentuk ikatan hidrogen intramolekul dan intermolekul. Hidrolisis sempurna selulosa menghasilkan glukosa, sedangkan hidrolisis tidak sempurna menghasilkan selobiosa dan oligosakarida. Struktur selulosa dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 3 Struktur selulosa Hemiselulosa merupakan rantai polimer bercabang dari berbagai jenis monomer gula-gula anhidro yang dapat dikelompokkan berdasarkan penyusunnya, yaitu heksosa glukosa, mannosa, galaktosa, pentosa xilosa, arabinopiranosa, arabinofuranosa, asam heksuronat glukoronat, metil glukoronat, galakturonat dan deoksi heksosa rhamnosa dan fruktosa. Struktur hemiselulosa berupa rantai bercabang, amorf, dengan ikatan yang lebih lemah dan lebih mudah larut dari pada selulosa. Gambar 4 berikut merupakan struktur dari hemiselulosa. Gambar 4 Struktur hemiselulosa Lignin yaitu polimer yang terdiri atas unit fenil propana melalui ikatan eter dan ikatan karbon. Terdapat tiga jenis fenil propionic alkohol yang merupakan monomer lignin yaitu coniferyl alkohol guaiacyl propanol, coumaryl alkohol p- hydroxyphenyl propanol dan sinapyl alkohol syringyl alkohol. Secara umum struktur lignin cukup kompleks dan adanya ikatan aril-alkil dan ikatan eter menyebabkan lignin tahan terhadap hidrolisis Judoamidjojo et al. 1989. Struktur lignin dapat dilihat pada Gambar 5. . Gambar 5 Struktur lignin Sixta, 2006 Rantai methoxyl Gugus fenol Cincin aromatik Gugus alkohol Ikatan eter -O- Ikatan karbon Pre-teatment untuk Bahan Lignoselulosa Hidrolisis bahan lignoselulosa dapat dilakukan dengan cara asam atau enzim, namun membutuhkan perlakuan pendahuluan pre-treatment untuk mempermudah reaksi oleh enzim. Pre-treatment yang diberikan haruslah efisien dan mampu melepaskan struktur kristalin selulosa, dapat mengembangkan sisi amorf dan melepaskan lignin disebut delignifikasi. Menurut Fengel dan Wegener 1995 delignifikasi idealnya menghilangkan lignin namun tidak menyebabkan kerusakan pada komponen holoselulosa selulosa dan hemiselulosa. Tujuan utama proses pre-treatment adalah untuk memperbesar akses enzim dalam melakukan hidrolisis. Akses enzim dapat ditingkatkan dengan cara menurunkan lignin, menurunkan kristalinitas selulosa, meningkatkan porositas dan luas permukaan bahan. Gambar 6 Pengaruh pre-treatment terhadap akses enzim pendegradasi Bioetanol dengan yield dan produktivitas rendah dan tinggi residu Bioetanol dengan yield dan produktivitas tinggi dan Rendah residu Enzim pendegradasi Tanpa pre-treatment Pre-treatment Lignoselulosa Serat selulosa Hemiselulosa Makrofibril Lignin Mikrofibril Enzim pendegradasi Selulosa Sejumlah reaksi heterogen terjadi pada hidrolisis menggunakan asam pada konsentrasi rendah dan menyebabkan terbentuknya “hydrocellulose”, yaitu produk dengan derajat polimerisasi yang rendah namun kristalinitas yang lebih tinggi. Hidrolisis selulosa sangat dipengaruhi oleh derajat kristalinitas dan bentuk swelling selulosa. Kinetika hidrolisis selulosa secara asam sangat tergantung pada ikatan hidrogen, sehingga sangat berguna untuk memungkinkan terjadinya proses sakarifikasi biomassa. Contoh yang diberi perlakuan asam 65 mampu mengubah bentuk serat selulosa menjadi selulosa berbentuk seperti gel Xiang et al. 2003. Proses pre-treament dapat dilakukan melalui beberapa metode yaitu secara fisik, kimia atau fisiko kimia, dan biologis. Tabel 4 memperlihatkan metode pre- treatment dan bentuk biomassa setelah mengalami proses perlakuan pendahuluan. Tabel 4 Pengaruh pre-treatment terhadap bentuk biomassa Metode Proses Perubahan pada biomassa Fisik  Penggilingan  Iradiasi  Lainnya seperti hidrotermal, penggunaan tekanan tinggi dan pirolisis.  Transformasi struktur lignin  Meningkatkan porositas dan luas permukaan bahan  Menurunkan kristalinitas selulosa  Menurunkan derajat polimerisasi Kimia dan fisiko- kimia  Explosion  Alkali  Asam  Gas  Agen oksidasi  Ekstraksi pelarut  Meningkatkan luas permukaan bahan  Delignifikasi parsial atau hampir lengkap  Menurunkan kristalinitas selulosa  Menurunkan derajat polimerisasi  Hidrolisis hemiselulosa parsial atau lengkap Biologis Fungi dan Aktinomiset  Delignifikasi  Mereduksi derajat polimerisasi selulosa  Hidrolisis hemiselulosa secara parsial Sumber: Taherzadeh dan Karimi 2008 Iradiasi Gelombang Mikro Gelombang mikro merupakan gelombang elektromagnetik yang berada pada daerah antara infrared dan frekuensi radio. Daerahnya antara 300 MHz – 30 GHz. Microwave domestik dan industrial dioperasikan pada 900 MHz – 2,45 GHz. Jantung dari microwave disebut dengan megatron yang akan menghasilkan radiasi listrik. Pada frekuensi 2,45 GHz, energi foton yang dibawa microwave sekitar 1 joule per mol. Jika bahan yang mengandung molekul polar dan ion diradiasi oleh microwave maka radiasi ini akan mepercepat proses kimia, biologi, dan fisik Sridar 1998. Keuntungan menggunakan microwave yaitu energi yang dibutuhkan rendah, prosesnya beragam dan selektif, dapat bekerja secara otomatis dan waktu yang dibutuhkan relatif singkat Datta 2001. Iradiasi microwave pada bahan akan menyebabkan dua efek yaitu efek termal dan non termal. Efek termal yaitu dengan mempercepat pemanasan dan efek non termal dengan mengintensifkan tumbukan antar partikel yang selanjutnya akan mempengaruhi laju reaksi Keshwani 2009. Peran Iradiasi Microwave terhadap Degradasi Pati dan Lignoselulosa Penelitian tentang penggunaan pemanasan microwave untuk degradasi pati telah digunakan untuk bahan seperti gandum, beras, kentang dan jagung, baik dalam larutan air maupun asam. Kebanyakan kajian menggunakan microwave oven 2450 MHz. Konsentrasi pati bervariasi antara 1-50, namun umumnya 10 pati Yu et al. 1996 dan Kunlan et al. 2001, sedangkan pada konsentrasi yang lebih tinggi telah dilakukan oleh Khan et al. 1979, Palav dan Seetharaman 2006 dan Nikolic et al. 2008. Hanya sedikit peneliti yang mencantumkan suhu seperti Yu et al. 1996 dan Tsubaki et al. 2009. Sebagian besar hanya mencantumkan derajat power yang digunakan atau persentase dari power Kunlan et al. 2001, Palav dan Seetharaman 2006, Nikolic et al. 2008. Tsubaki et al. 2009 melaporkan proses pelarutan pati pada suhu tinggi, sebagian besar pati larut pada suhu 200 sampai 220 o C namun diikuti oleh dekomposisi produk menjadi produk sekunder yang memberi warna kegelapan. Waktu terlama yang telah digunakan adalah 10 menit, namun proses hidrolisis pati berjalan sempurna kurang dari 10 menit. Perlakuan pemanasan pati dengan microwave dapat menggunakan air atau asam pada konsentrasi rendah, baik HCl atau H 2 SO 4 . Namun Kunlan et al. 2001 telah melaporkan penambahan garam yang mengandung ion Cl dan SO 4 dapat meningkatkan laju hidrolisis pati. Enzim Hidrolisis Proses hidrolisis dapat dilakukan menggunakan asam maupun secara enzimatis. Hidrolisis asam akan menghasilkan etanol dengan yield yang rendah menimbulkan masalah korosi dan menghasilkan produk samping yang dapat menghambat proses fermentasi Safitri et al. 2009. Hidrolisis enzimatis bersifat spesifik dan ramah lingkungan. Enzim yang digunakan untuk hidrolisis pati yaitu enzim amilolitik sedangkan selulosa dihidrolisis oleh selulolitik dan hemiselulosa oleh xilanolitik. Enzim amilolitik bekerja menghidrolisis polisakarida pati menjadi gula- gula sederhana. Enzim amilolitik yang digunakan untuk mendegradasi pati adalah α-amilase yang akan memecah pati menjadi maltosa. Enzim ini bekerja memutus ikatan α-1,4-glikosidik pada amilosa, amilopektin dan glikogen. Ikatan α-1,6- glikosidik tidak dapat diputus oleh α-amilase namun dapat dibuat menjadi cabang- cabang yang lebih pendek Dordick 1991. Amiloglukosidase juga merupakan enzim amilolitik yang bekerja memecah ikatan α-1,4, α-1,6, α-1,3, α-1,2, dan α-1,1 glikosidik. Enzim ini bekerja lebih lambat dibandingkan enzim α- amilase. Enzim selulolitik bekerja mengkonversi selulosa menjadi glukosa. Enzim ini terdiri atas kompleks endo- β-1,4-glukanase, kompleks ekso- β-1,4-glukanase, da n β-1,4-glukosidase. Enzim ini dapat mengkonversi selulosa menjadi glukosa. Enzim xilanolitik terdiri dari kompleks 1,4- β-endoxilanase, β-xilosidase, α-L- arabionofuronase, α-glukoronidase, asetil xilan esterase dan asam fenolat. Enzim ini bekerja mengkonversi xilan menjadi xilosa. Tabel 5. Karakteristik Enzim Selulolitik dan Xilanolitik dari Isolat Lokal Karakterisitk Enzim Selulase Xilanase 1 2 Mikroorganisme Bakteri Isolat J Streptomyces 234-P16 Suhu optimum o 60 C 90 pH optimum 6.5 5.0 Waktu optimum hari 7 5 Aktivitas puncak Uml 0.057 0.27 Sumber : 1 Sinaga 2010, 2 Meryandini et al. 2008 Bioetanol Etanol etil alkohol merupakan cairan yang mudah menguap, mudah terbakar, tak berwarna, memiliki bau khas alkohol, dan merupakan alkohol yang paling sering digunakan dalam kehidupan sehari-hari. Etanol termasuk ke dalam alkohol rantai tunggal, dengan rumus kimia C 2 H 5 OH dan rumus empiris C 2 H 6 O dengan berat molekul 46,07 gmol. Etanol dapat dibuat dari bahan nabati yang mengandung gula, pati atau lignoselulosa yang dikenal dengan istilah bioetanol. Bioetanol dapat diproduksi melalui proses fermentasi oleh khamir. Khamir merupakan jamur bersel satu yang bersifat mikroskopis, tidak memiliki flagel, tetapi ada beberapa yang membentuk filamen, bersifat saprofit dan parasit. Khamir tumbuh baik pada kondisi aerobik, walaupun demikian beberapa khamir dapat tumbuh pada kondisi anaerobik. Khamir dapat tumbuh dan memfermentasi gula menjadi etanol pada pH 3.5-6.0 dan suhu 28-35 o C. Fermentasi etanol memerlukan waktu 30-72 jam dengan suhu optimum untuk fermentasi antara 25- 30 o Khamir akan mengubah gula sederhana menjadi etanol melalui jalur Embden Meyerhoff-Parnas EMP. EMP mengubah glukosa menjadi asam piruvat melalui reaksi oksidasi-reduksi. Asam piruvat yang dihasilkan kemudian didekarboksilasi menjadi asetaldehida lalu mengalami dehidrogenasi sehingga terkonversi menjadi etanol. C, dan kadar gula berkisar antara 10-18 Paturau 1969. Bioetanol dapat diproduksi dari berbagai biomassa hasil pertanian, namun secara tradisional bahan hasil pertanian yang digunakan adalah yang mengandung gula dan pati. Gula sederhana dapat langsung digunakan oleh khamir, sedangkan pati dapat dengan mudah dikonversi dahulu menjadi glukosa oleh enzim atau asam, kemudian difermentasi oleh khamir menjadi etanol. Varga et al. 2004 memproduksi etanol dari jagung, limbah jagung dan tongkol jagung dan memperlihatkan kemampuan Saccharomyces cerevisiae dalam menggunakan fraksi hemiselulosa sebagai sumber karbon untuk fermentasi etanol. METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi serta Laboratorium Bioindustri, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor pada bulan Juni – November 2010. Bahan dan Alat Bahan Bahan-bahan yang digunakan antara lain empulur sagu, bakteri isolat lokal penghasil enzim selulase Bakteri isolat J dan penghasil enzim xilanase Streptomyces 234P-16 koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, media untuk isolasi: Yeast Malt Extract Agar YMEA, Yeast Glucose Chloramphenicol YGC, Potato Dextose Agar PDA, Potato Dextose Broth PDB, nutrien untuk produksi biotenol NPK dan ZA, glukosa, xilosa, bufer sitrat dan fosfat, ekstrak khamir, agar-agar, xilan oatspelt, reagen DNS, akuades, kapas, tissue, dan alkohol 96. Alat Peralatan yang digunakan antara lain Hammer mill, Microwave oven merk SHARP tipe R-348 C dengan output 1000 W, Reaktor untuk produksi bioetanol, Gas Chromatography serta instrumen dan peralatan gelas. Metode Penelitian Penelitian dilaksanakan dalam empat tahap yang meliputi 1 isolasi dan seleksi khamir, 2 penyiapan enzim, 3 hidrolisis empulur sagu dan 4 produksi bioetanol. Diagram alir penelitian disajikan pada Gambar 7. Gambar 7 Diagram alir penelitian Isolasi dan Seleksi Khamir Isolasi khamir dilakukan terhadap 5 macam buah yang telah membusuk yaitu apel, melon, nenas, pepaya dan semangka yang berasal dari toko buah lokal. Isolasi dilakukan dengan menimbang 1 g sampel buah-buahan secara aseptis. Kemudian dibuat serial pengenceran hingga 10 -4 dalam larutan fisiologis NaCl 0.85. Sebanyak 1 ml sampel dari serial pengenceran 10 -3 dan 10 -4 diinokulasikan pada media YMEA yeast malt extract agar pada suhu ruang selama 48 jam. Koloni yang tumbuh kemudian diisolasi kembali dari mikroba lain dengan cara menginokulasi pada mediaYGC yeast glucose chloramphenicol yang diperkaya tetrasiklin. Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu ruang. Koloni khamir Pre-treatment Pemanasan konvensional dan microwave Pengeringan dan pengecilan ukuran 32 mesh Produksi enzim selulase dan xilanase dari isolat lokal Empulur sagu Analisis total gula, gula pereduksi, serat mikroskopis Hidrolisis menggunakan konsorsium enzim 72 jam Fermentasi pH 5, 30 °C, 120 rpm, 72 jam Analisis total gula, gula pereduksi, derajat polimerisasi Khamir isolat unggul Analisis proksimat dan komponen serat Isolasi pada YMEA Isolasi pada YGC + tetrasilkin Seleksi pada substrat glukosa 10 dan glukosa-xilosa 1:1 Etanol Apel, pepaya, semangka, melon dan nenas busuk Likufikasi dan sakarifikasi enzimatis Analisis total gula, gula pereduksi dan serat mikroskopis Analisis parameter fermentasi dan kadar etanol GC kemudian dimurnikan dengan teknik kuadran hingga diperoleh isolat koloni tunggal dan dipindahkan pada media PDA potato dextrose agar. Isolat khamir yang diperoleh kemudian diseleksi berdasarkan kemampuannya mengkonsumsi substrat dengan cara memfermentasikan isolat khamir pada media yang mengandung glukosa 10 dan campuran glukosa- xilosa 1:1 selama 72 jam kemudian diuji kinerjanya melalui analisis perubahan total gula dan gula pereduksi, pembentukan volume CO 2 Penyiapan Enzim dan kadar etanol yang dihasilkan dengan GC Gas Chromatography. Prosedur analisis total gula dan gula pereduksi disajikan pada Lampiran 1. Produksi Enzim Xilanase Produksi enzim xilanase dilakukan berdasarkan hasil penelitian Meryandini et al. 2008, yaitu dimulai dengan kultivasi Streptomyces 234P-16 pada media agar xilan 0.5 selama 5 hari pada suhu ruang. Komposisi media agar-agar xilan terdiri atas xilan 0.5 ; sukrosa 10.3 ; ekstrak khamir 1; dan agar-agar 2. Setelah itu dilakukan inokulasi 2 cockborer koloni pada media xilan cair. Inkubasi dilakukan menggunakan shaker selama 5 hari pada suhu 28 o Produksi Enzim Selulase C. Ekstrak kasar enzim dipanen dengan sentrifugasi pada 240 rpm selama 5 menit. Aktivitas enzim ditentukan berdasarkan pembentukan gula sederhana xilosa yang diuji menggunakan metode DNS Miller 1959. Prosedur analisis gula sederhana metode DNS disajikan pada Lampiran 1. Produksi enzim xilanase dilakukan berdasarkan hasil penelitian Meryandini et al. 2009 yaitu dengan menumbuhkan Bakteri Isolat J pada media agar-agar CMC dengan komposisi CMC 1; MgSO 4 7H 2 O 0.02; KNO 3 0.075; K 2 HPO 4 0.05; FeSO 4 7H 2 O 0.002; CaCl 2 0.004; ekstrak khamir 0.2; glukosa 0.1; dan agar 2. Pengkulturan isolat dilakukan selama 2 hari pada suhu 30 o C. Sebanyak 1-2 loop bakteri diinokulasikan dalam 100 ml media CMC cair selama 2 hari pada suhu ruang. Ekstrak kasar enzim dipanen dengan sentrifugasi pada 240 rpm selama 5 menit dan diuji aktivitasnya sebagai CMC- ase. Prosedur analisis aktivitas selulase disajikan pada Lampiran 2. Hidrolisis empulur sagu a. Pre-treatment perlakuan pendahuluan empulur sagu Sebelum pre-treatment, bahan baku berupa empulur sagu terlebih dahulu diparut dan dikeringkan dengan sinar matahari kemudian dilanjutkan dengan pengeringan menggunakan oven pada suhu 50 o Pre-treatment dilakukan pada 50 ml empulur sagu dengan konsentrasi 8 melalui pemanasan konvensional 105 C selama 24 jam dan digiling hingga berukuran 35 mesh. Komponen kimia empulur sagu dianalisis sebagai komponen proksimat air, abu, lemak, protein, serat kasar dan karbohidrat dan komponen serat hemiselulase, selulase, lignin. Prosedur analisis proksimat dan komponen serat disajikan pada Lampiran 3. o

b. Likuifikasi

C, 15 menit atau pemanasan microwave pada power level 50 500 W selama 2 menit Derosya 2010. Perubahan komposisi karbohidrat akan dianalisis dengan total gula, gula pereduksi Miller 1959 dan derajat polimerisasi hidrolisat pati. Perubahan pada struktur pati dan serat dianalisis dengan pengamatan mikroskopik. Prosedur analisis total gula dan gula pereduksi disajikan pada Lampiran 1. Proses likuifikasi dilakukan dengan menambahkan enzim α-amilase komersial thermamyl menurut metode dari penelitian sebelumnya yaitu 1.75 Ug Akyuni 2004 kemudian diinkubasi selama 3 jam pada suhu 95 o

c. Sakarifikasi

C. Perubahan komposisi karbohidrat akan dianalisis dengan total gula, gula pereduksi Miller 1959 dan derajat polimerisasi hidrolisat pati. Pada tahap ini ditentukan kondisi sakarifikasi empulur sagu yang telah mengalami pre-treatment. Proses sakarifikasi dilakukan dengan menambahkan konsorsium 3 enzim yaitu amiloglukosidase komersial dextrozyme 0.3 Ug, selulase 1 Ug dan xilanase 1 Ug pada suhu 60 o C. Proses berlangsung selama 120 jam dan perubahan komposisi karbohidrat akan dianalisis dengan total gula, gula pereduksi Miller 1959 dan derajat polimerisasi hidrolisat pati. Perubahan pada struktur pati dan serat dianalisis dengan pengamatan mikroskopik. Prosedur analisis total gula, gula pereduksi dan derajat polimerisasi disajikan pada Lampiran 1. Produksi Bioetanol Produksi etanol menggunakan khamir isolat unggul hasil isolasi dengan menggunakan produk sakarifikasi yang dihasilkan dari tahap sebelumnya dan diperkaya dengan pupuk NPK dan ZA. Fermentasi berlangsung secara tertutup tanpa aerasi. Desain peralatan untuk proses fermentasi disajikan pada Gambar 8. Evolusi CO 2 yang dilepaskan dari sistem diukur dan dihitung sebagai laju pembentukan gas per 6 jam selama 12 jam pertama dan dilanjutkan per 12 jam hingga 72 jam. Setelah 72 jam, kultur ditetapkan pHnya, kandungan total gula residu Dubois et al. 1956, gula pereduksi Miller 1959, total asam titrasi asam, dan parameter fermentasi seperti Yps perolehan g produk per g substrat dan ∆ SS penggunaan substrat. Konsentrasi etanol ditentukan dengan Gas Chromatography GC. Prosedur analisis total gula, gula pereduksi, total asam dan parameter fermentasi disajikan pada Lampiran 1. Gambar 8 Sistem fermentasi dalam labu Erlenmeyer menggunakan labu leher angsa. waterbath shaker labu leher angsa H 2 SO 4 pekat selang plastik bak plastik sumbat karet Gelas ukur