4. Kromatografi Kolom
Isolasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom gravitasi. Langkah pertama diawali dengan melakukan impregnasi ekstrak pekat
menggunakan eluen yang akan dipakai berupa penambahan silika gel dengan komposisi berat ekstrak dan silika gel 1 : 10. Impregnasi dilakukan agar
komponen ekstrak terdistribusi merata dalam silika sehingga proses kromatografi kolom akan lebih teratur dan terkontrol. Eluen yang digunakan sama dengan
eluen pada proses KLT yang diperoleh dengan cara optimasi. Hasil elusi ditampung dalam vial
– vial berukuran 15 mL dan keberadaan senyawa yang tereluen dikontrol dengan melakukan penotolan pada plat KLT. Untuk vial yang
memberikan bercak yang sama dapat digabungkan satu sama lain.
5. Penentuan Struktur Flavonoid
Penentuan struktur flavonoid dilakukan dengan menginterpretasi data-data dari spektroskopi
1
H-NMR terhadap senyawa uji yang diperoleh dari kromatografi kolom. Penentuan struktur difokuskan pada senyawa yang memiliki
indikasi antioksidan yaitu dengan melihat pola kromatogram pada plat KLT yang positif terhadap sitroborat dan larutan DPPH 0,2.
6. Uji Aktivitas Antioksidan a. Uji Kualitatif
Sebelum diuji potensi antioksidannya, plat KLT disemprot dengan larutan DPPH 0,2. Positif antioksidan ditandai dengan perubahan warna larutan DPPH
pada bercak KLT dari biru menjadi kuning setelah 30 menit.
b. Uji Potensi Antioksidan IC
50
Potensi antioksidan dilakukan dengan tahap berikut : i. Pembuatan larutan DPPH
Larutan pereaksi adalah DPPH dalam metanol yang selalu dibuat baru dan dijaga pada suhu rendah dan terlindung dari cahaya. Larutan DPPH dibuat pada
konsentrasi yang memberi serapan pada angka sekitar 1,0 yaitu pada konsentrasi 50-100
M Molyneux, 2004.
ii. Pembuatan seri konsentrasi larutan uji Ditimbang 5 mg senyawa uji lalu dilarutkan dalam metanol sehingga
diperoleh konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm. Selanjutnya tambahkan DPPH 50
gmL dengan perbandingan volume yang sama 1:1 pada setiap seri konsentrasi dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37
o
C. Absorbansi diukur pada
515 - 517 nm tergantung pada maksimal hasil optimasi. Untuk kontrol positif digunakan larutan vitamin C dengan kadar 2, 5, 7, 10 dan 50 ppm dan
diperlakukan sama seperti pada larutan uji
Kategori