Isolasi Senyawa Flavonoid Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid 1. Aspek Umum

Prinsip KLT adalah adanya interaksi senyawa uji terhadap fase diam adsorben atau terhadap fase gerak eluen yang digunakan. Fase diamnya terikat pada suatu lempeng kaca, plastik atau aluminium. Bahannya berupa alumina, selulosa, diatomae atau silika SiO 2 . Jenis yang paling banyak digunakan adalah silika gel. Senyawa uji akan naik mengikuti fase gerak sesuai dengan kemampuan interaksinya terhadap adsorben. Makin kuat interaksinya, maka dia akan sedikit bergerak berinteraksi kuat dengan adsorben sehingga memiliki jarak rambat yang rendah. Sebaliknya, jika senyawa uji memiliki interaksi yang lebih besar dengan fase gerak maka dia akan mempunyai jarak rambat yang lebih jauh. Pemilihan pelarut sebagai fase gerak merupakan faktor penentu berhasil tidaknya suatu matriks campuran dapat dipisahkan dari komponen penyusunnya dengan sempurna Sastrohamidjojo, 1991. Data kualitatif yang diperoleh dari KLT adalah Rf Retardation factor, yaitu : Rf = jarak rambat senyawa Jarak perambatan Suatu senyawa uji dianggap identik bila memiliki harga Rf yang samamirip dengan harga Rf suatu senyawa standar pada perlakuan yang sama. b . High Performance Thin Layer Chromatography HPTLC Untuk meningkatkan kapasitas dan selektifitas KLT maka dikembangkan fase diam KLT dengan ukuran partikel yang sangat kecil dan diintegrasikan dengan penotol otomatis, chamber otomatis dan perangkat visualisasi yang mumpuni yang selanjutnya diperkenalkan sebagai HPTLC. Tujuan utamanya adalah meningkatkan separasi bercak senyawa sehingga pola kromatogram yang terbentuk dapat digunakan sebagai sidik jari bagi suatu matriks senyawa uji. Penggunaan HPTLC kini makin banyak digunakan karena prosesnya cepat dan limit deteksinya tinggi. Keunggulan HPTLC dibandingkan dengan KLT konvensional dirangkum dalam Tabel 3. Tabel 3 . Perbandingan keunggulan HPTLC dibandingkan KLT konvensional Wagner et al., 1996. Parameter HPTLC KLT Ukuran partikel fase diam Distribusi ukuran partikel Jumlah sampel dalam satu plat Sampel volume Batas deteksi Dimensi bercak Diameter separasi bercak Waktu elusi 5 – 6 m 4 – 8 m 36 0,1 – 0,5 L 100 – 500 pikogram Sferis 2 - 6 mm 3 – 20 menit 10 – 12 m 5 – 20 m 10 1 – 5 L 1 -5 nanogram Tidak beraturan 6 - 15 mm 30 – 200 menit

4. Pemisahan Senyawa Dengan Kromatografi Kolom

Prinsip utama kromatografi kolom hampir sama dengan KLT, perbedaan terletak pada jumlah fase diam dan fase gerak yang digunakan. Pada kromatografi kolom fase diam yang dipakai tergantung pada panjang dan besar kolom yang digunakan, begitu juga fase geraknya tergantung pada jumlah senyawa yang akan dipisahkan dan dimensi kolom yang dipakai.