Oleh karena itu, harus ada modifikasi pada metode yang digunakan dan standarisasi pada bahan yang akan diekstraksi. Menurut Satishkumar et al. 2008,
faktor-faktor yang berpengaruh dalam ekstraksi senyawa flavonoid adalah waktu ekstraksi, suhu, jenis dan komposisi pelarut serta perbandingan pelarut terhadap
bahan yang akan diekstraksi.
2. Isolasi Senyawa Flavonoid
Metode ekstraksi untuk senyawa flavonoid yang sederhana namun memberikan hasil yang baik adalah maserasi Turkmen et al., 2006, yaitu dengan
melakukan perendaman bahan lalu dilanjutkan dengan pemisahan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis KLT. Metode ini walaupun sederhana namun dapat
diandalkan dan dapat memberikan hasil yang sepadan dibandingkan metode lain yang lebih rumit Yaxin et al., 2005; Svetlana et al., 2013.
Metode maserasi cocok untuk mengekstraksi senyawa flavonoid mengingat karakteristiknya yang cenderung mudah teroksidasi dan tidak tahan panas bila
dilakukan dengan metode lain seperti refluks dan destilasi. Prinsip metode ini adalah adanya perbedaan gradien tekanan antara bagian dalam sel dan luar sel
sehingga akan terjadi pembengkakan dan pemecahan membran serta dinding sel sehingga akan terjadi difusi bahan aktif yang akan masuktertarik kedalam sistem
pelarut yang digunakan. Proses ini biasanya berlangsung antara 1- 3 hari bahkan dalam Farmakope disebutkan bahwa proses maserasi bisa berlangsung sampai 10
hari Anonim, 2000.
3. Pemisahan Senyawa Dengan KLT a. Prinsip Kerja KLT
Pemisahan bahan aktif dilakukan dengan 2 tahap, yaitu skrining fitokimia melalui fraksinasi dan dilanjutkan dengan pemisahan untuk tujuan pemurnian.
Fraksinasi merupakan proses yang didasarkan pada adanya perbedaan kelarutan bahan uji terhadap pelarut yang digunakan.
Tahap fraksinasi diawali dengan pelarut non polar lalu dilanjutkan secara bertahap dengan pelarut yang lebih polar Harborne, 1987. Jenis pelarut dipilih
berdasarkan sifat bahan aktif yang akan diisolasi. Untuk senyawa flavonoid, fraksinasi diawali dengan heksana dan diakhiri dengan pelarut polar. Metode
pemisahan yang umum digunakan untuk bahan alam di antaranya adalah kromatografi seperti kromatografi kertas, kromatografi kolom, kromatografi cair
kinerja tinggi dan kromatografi gas. Tiap metode memiliki kelemahan dan kelebihan masing-masing dan tidak ada metode yang diklaim paling baik.
Secara umum, untuk senyawa-senyawa yang berada pada rentang polar sampai semi polar seperti senyawa flavonoid, KLT cocok digunakan dan
efektifitas pemisahan diperoleh dengan melakukan penetapan komposisi fase gerak sedemikian rupa sehingga diperoleh hasil pemisahan yang sempurna
Harborne, 1987.
