Tujuan utamanya adalah meningkatkan separasi bercak senyawa sehingga pola kromatogram yang terbentuk dapat digunakan sebagai sidik jari bagi suatu
matriks senyawa uji. Penggunaan HPTLC kini makin banyak digunakan karena prosesnya cepat dan limit deteksinya tinggi. Keunggulan HPTLC dibandingkan
dengan KLT konvensional dirangkum dalam Tabel 3. Tabel 3
. Perbandingan keunggulan HPTLC dibandingkan KLT konvensional Wagner et al., 1996.
Parameter HPTLC
KLT
Ukuran partikel fase diam Distribusi ukuran partikel
Jumlah sampel dalam satu plat Sampel volume
Batas deteksi Dimensi bercak
Diameter separasi bercak Waktu elusi
5 – 6 m
4 – 8 m
36 0,1
– 0,5 L 100
– 500 pikogram Sferis
2 - 6 mm 3
– 20 menit 10
– 12 m 5
– 20 m 10
1 – 5 L
1 -5 nanogram Tidak beraturan
6 - 15 mm 30
– 200 menit
4. Pemisahan Senyawa Dengan Kromatografi Kolom
Prinsip utama kromatografi kolom hampir sama dengan KLT, perbedaan terletak pada jumlah fase diam dan fase gerak yang digunakan. Pada kromatografi
kolom fase diam yang dipakai tergantung pada panjang dan besar kolom yang digunakan, begitu juga fase geraknya tergantung pada jumlah senyawa yang akan
dipisahkan dan dimensi kolom yang dipakai.
Oleh karena itu kromatografi kolom efektif untuk tujuan kuantitatif artinya dapat digunakan untuk isolasi senyawa dalam jumlah besar.
E. Identifikasi Senyawa Flavonoid 1. Pereaksi Semprot
Identifikasi awal senyawa golongan flavonoid dapat dilakukan dengan berbagai cara di antaranya adalah menggunakan pereaksi semprot pada lempeng
KLT seperti terlihat pada Tabel 4 berikut Harborne, 1987. Tabel 4
. Jenis pereaksi semprot dan flavonoid yang terdeteksi Harborne, 1987 Pereaksi
Referensi Tipe
flavonoid 1. Difenil-asam
borat-etanolamin 1 dalam etanol
2. Feri kloridametanolik
3. Aluminium klorida 2 dalam metanol,
UV 4. Zirkonium
oksiklorida 2 dalam metanol, UV
5. Ceric sulfat 70 dalam H
2
SO4 6. Amonia uap, UV
7. Amoniakal perak
nitrat
8. NaOH 1 dalam Metanol
Dass dan Weaver, 1972; Quarmby, 1968;
Gupta, 1968; Neu, 1957 Spiegel, 1969; Kirchner, 1967; Beck
dan Knox ,1971 Stahl, 1969
Dass dan Weaver, 1972; Kirchner, 1967;
Mabry et.al, 1970
Harborne, 1987
Dass dan Weaver, 1972 Sebagian
besar flavonoid
Sebagian besar
flavonoid
Sebagian besar
flavonoid
2. Spektroskopi UV -VIS
Cara lain yang dipakai untuk identifikasi senyawa flavonoid adalah menggunakan spektroskopi UV-VIS yang saat ini umum digunakan karena
sifatnya yang tidak destruktif. Prinsip utama metode ini adalah mendeteksi adanya serapan gelombang UV-VIS pada cincin aromatis terkonjugasi dari
struktur flavonoid yang menyebabkan pita pada dua daerah yang berbeda yaitu 300-560 nm pita I dan 230-295 nm pita II. Hal ini tejadi karena struktur umum
flavonoid terdiri dari dua kerangka gugus kromofor yaitu cincin benzoil pita II
dan cincin sinamoil pita I seperti terlihat pada Gambar 5.
5 6 4
8
O
1 3
1 7
2 2 6 3
5 4
O
O O
PITA II 240 -280 nm Kromofor Benzoil
PITA I 300 -550 nm Kromofor Sinamoil
Gambar 5 . Struktur penyusun senyawa flavonoid
