III. BAHAN DAN METODE
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah pati sagu Metroxylon sp yang didapatkan dari Bogor, enzim
α-amilase Termamyl dan enzim amiloglukosidase AMG yang didapatkan dari Novo Industri.
Bahan-bahan kimia untuk pembuatan dan analisa hidrolisat pati sagu yaitu CaCO
3,
HCL, NaOH, larutan iod, larutan kanji, H
2
SO
4,
larutan KI, pereaksi DNS 3,5 asam dinitrosalisitat, larutan standar glukosa, etanol, dan akuades.
Sementara itu bahan-bahan yang diperlukan untuk fermentasi adalah kultur murni Saccharomyces cerevisiae, ragi roti merk Fermipan, PDA Potato
Dekstrose Agar
, GYE
Glucose Yeast
Extract untuk
media perkembangbiakan, pupuk NPK dan ZA sebagai sumber nutrien dalam media
fermentasi etanol. Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi peralatan gelas, shaker,
otoklaf, spektofotometer, desikator, oven, cawan porselen, cawan alumunium, termometer, pH-meter, buret, pipet, dan Soxhlet Apparatus. Peralatan untuk
fermentasi adalah fermentor kapasitas 2 liter, pH-meter, gelas ukur, labu erlenmeyer, dan jarum ose.
B. METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama.
1. Penelitian Pendahuluan
a. Penyiapan Media Fermentasi Sebelum dilakukan hidrolisis pati sagu dilakukan karakterisasi pati
sagu. Karakterisasi pati yang dilakukan meliputi analisa kadar air, kadar abu, kadar serat kasar, kadar lemak dan kadar pati. Prosedur
karakterisasi pati sagu dapat dilihat pada Lampiran 2.
Hidrolisis pati sagu dilakukan menggunakan metode enzimatis Akyuni, 2004. Enzim yang digunakan sebelumnya dihitung
aktivitasnya agar jumlah enzim yang digunakan sesuai dengan dosis yang diperlukan. Prosedur pengukuran aktivitas enzim dapat dilihat
pada Lampiran 3. Hidrolisat pati sagu yang dihasilkan kemudian diuji kadar gula total, kadar gula pereduksi, Ekuivalen dekstrosa DE,
derajat polimerisasi DP dan pH. Diagram alir proses hidrolisis pati sagu diperlihatkan pada Lampiran 4, prosedur analisa hidrolisat pati
sagu diperlihatkan pada Lampiran 5. b. Penyiapan Inokulum
1. Penyiapan Inokulum Saccharomyces cerevisiae Kultur murni Saccharomyces cerevisiae dibiakkan pada agar
miring PDA selama 48 jam dengan kondisi aerobik dan suhu kamar sebelum diinokulasi pada media cair GYE Rinaldy, 1987.
Kultur hasil biakan pada PDA selanjutnya dibiakkan pada media GYE sebelum dipakai pada fermentasi. Pembiakkan dilakukan
dengan menginokulasi sebanyak 1 jarum ose ke dalam 20 ml media GYE dalam labu erlenmeyer 100 ml. Waktu inkubasi adalah
selama 24 jam pada suhu kamar dengan kondisi aerobik. Hasil biakan digunakan sebagai inokulum pada fermentasi utama.
Jumlah sel yang terkandung di dalam inokulum dihitung menggunakan hemasitometer.
2. Pemilihan Metoda Penyiapan Inokulum Ragi roti Berdasarkan penelitian Daulay 1999 pembuatan inokulum
fermentasi menggunakan ragi roti dilakukan dengan mengganti 1 ose kultur murni Saccharomyces cerevisiae dengan 1 gram ragi
roti dengan metode penyiapannya sama dengan penyiapan inokulum kultur murni. Selain itu dilakukan pula penyiapan
inokulum sesuai dengan petunjuk pada kemasan ragi roti yaitu ragi roti dapat digunakan langsung pada pembuatan roti dengan
prosedur sebagai berikut
1. Ragi roti ditimbang sesuai keperluan. 2. Ragi roti dimasukkan ke dalam air hangat.
3. Ragi roti ke dimasukkan ke dalam media fermentasi. Untuk mendapatkan bobot gram ragi roti yang setara dengan
1 ose kultur murni Saccharomyces cerevisiae maka dilakukan penghitungan jumlah sel pada inokulum dari beberapa perlakuan.
Perlakuan yang dilakukan adalah 1. Menumbuhkan 1 gram ragi roti pada 20 ml media GYE
selama 24 jam. 2. Menumbuhkan 0.1 gram ragi roti pada 20 ml media GYE
selama 24 jam . 3. Mencampurkan 0.1 gram ragi roti dengan 20 ml air suhu
30
o
C. Jumlah ragi roti dan metode yang digunakan pada fermentasi
utama adalah perlakuan yang menghasilkan jumlah sel inokulum yang sama dengan jumlah sel inokulum kultur murni
Saccharomyces cerevisiae .
2. Penelitian Utama
a. Penentuan Konsentrasi Substrat dan Jenis Inokulum Terbaik
Penentuan konsentrasi substrat dan jenis inokulum terbaik dilakukan pada labu erlenmeyer 300 ml. Substrat fermentasi berupa
hidrolisat pati sagu sebanyak 100 ml dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dengan konsentrasi gula dan jenis inokulum berbeda. Nilai
pH cairan substrat diatur 4.8. Kemudian, media dipasteurisasi pada suhu 80
o
C selama 5 menit, setelah itu media didinginkan hingga 30
o
C. Selanjutnya inokulum sebanyak 10 volume substrat ditambahkan
pada media. Fermentasi berlangsung pada kondisi anaerobik. Pipa plastik dipasang pada kepala labu erlenmeyer dan ujungnya
dibenamkan ke air untuk menangkap gas CO
2
yang dihasilkan dari
proses fermentasi. Fermentasi berlangsung pada suhu kamar dengan lama fermentasi 72 jam. Pengamatan dilakukan pada awal dan akhir
fermentasi yang meliputi analisa kadar etanol, biomassa, gula pereduksi akhir dan CO
2
. Prosedur analisa gula pereduksi sama dengan
analisa hidrolisat pati, prosedur pengukuran biomassa dapat dilihat pada Lampiran 6 dan prosedur pengukuran kadar etanol dapat dilihat
pada Lampiran 7.
b. Perlakuan
Perlakuan yang diterapkan pada penelitian ini adalah: 1. Perlakuan konsentrasi gula yang berbeda yaitu 8 bv, 14 bv
dan 20 bv. 2. Perlakuan jenis inokulum yang berbeda yaitu kultur murni
Saccharomyces cerevisiae dan ragi roti.
c. Fermentasi Pada Fermentor 2 L
Perlakuan terbaik dari penelitian ini digunakan sebagai media fermentasi pada fermentor 2 liter. Pada fermentasi ini dilakukan
analisa biomassa, kadar etanol, volume CO
2
, dan gula pereduksi. Prosedur analisa
gula pereduksi sama dengan analisa hidrolisat pati. Prosedur analisa biomassa dijelaskan pada Lampiran 6 dan prosedur
pengukuran kadar etanol dapat dilihat pada Lampiran 7. Fermentasi dilakukan selama 72 jam dengan pengamatan tiap 3 jam sampai jam
ke-6, selanjutnya dilakukan pengamatan setiap 6 jam.
3. Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua kali ulangan. Rancangan percobaan
menggunakan 2 faktor yaitu konsentrasi gula sebagai sumber C dan faktor perbedaan jenis inokulum. Konsentrasi gula yang diujikan 3 taraf dan jenis
inokulum 2 taraf. Parameter yang diuji adalah kadar alkohol, kadar gula
pereduksi sisa, efisiensi pemanfaatan substrat dan pH. Model yang digunakan adalah berdasarkan Hanafiah 2005, sebagai berikut;
Y
ij
= µ + α
i
+ β
j
+ α
i
β
j
+ ε
ij
Y
ij
= µ
= Efek rata-rata yang sebenarnya α
i
= Efek dari taraf ke i konsentrasi gula β
j
= Efek dari taraf ke j jenis inokulum ε
ij
=
Model tersebut dianalisis sidik ragamnya menggunakan perangkat lunak SAS.
Variabel respon karena pengaruh bersama taraf konsentrasi gula taraf ke i dan jenis inokulum taraf ke j
Efek dari interaksi antara taraf ke i konsentrasi gula dan taraf ke j jenis inokulum
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. PENELITIAN PENDAHULUAN
a. Persiapan Media Fermentasi
Penelitian pendahuluan terdiri dari analisa proksimat pati sagu, hidrolisis pati sagu dan analisa hidrolisat pati sagu. Analisa proksimat pati
sagu terdiri dari analisa kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, kadar pati, kadar serat kasar, kadar amilosa, dan kadar amilopektin. Hasil
analisa proksimat kadar pati sagu Metroxylon sp. dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Karakteristik pati sagu
Karakteristik
1
Hasil Penelitian
Penelitian lain
2
SNI 01-3729-
1995
Kadar Air 5.08
5.76 Maksimum 13
Kadar Abu 0.11
0.12 0.5
Kadar Protein 0.36
0.38 -
Kadar Lemak 0.34
0.36 -
Kadar Serat Kasar 0.02
0.01 0.1
Kadar Pati 82.15
82.13 -
Kadar Amilosa 27.71
27.75 -
Kadar Amilopektin 72.29
72.25 -
1
Basis kering
2
Akyuni 2004 Kadar air dalam suatu produk atau bahan dapat mempengaruhi tingkat
mutunya. Kadar air yang tinggi dapat memudahkan tumbuhnya mikroorganisme sehingga dapat memperpendek umur simpannya.
Sebaliknya kadar air rendah dapat mengubah bentuk, sifat fisik dan kimia suatu bahan. Kadar air pati sagu yang digunakan dalam penelitian ini
adalah 5.08 . Kadar air pati berpengaruh dalam pembuatan hidrolisat pati
sagu pada penentuan rasio pati sagu dengan air yang ditambahkan untuk menghasilkan substrat yang diinginkan.
Abu merupakan zat organik yang dihasilkan dari proses pembakaran yang dikenal sebagai unsur mineral. Kadar abu hasil penelitian mencapai
0.11 . Kadar abu dari pati sagu yang dihasilkan memiliki kandungan mineral atau zat anorganik yang rendah. Pada pembuatan hidrolisat pati
sagu, kadar abu pati dapat mempengaruhi proses hidrolisis pati karena kandungan mineral pada pati yang tinggi dapat menghambat proses
hidrolisis pati. Kadar lemak dan kadar protein hasil pengujian sagu adalah 0.34 dan
0.36. Kadar protein yang terkandung dalam pati dapat mempengaruhi warna sirup glukosa. Reaksi yang terjadi antara gula pereduksi dengan
protein pada suhu tinggi akan menghasilkan warna coklat atau disebut juga reaksi browning.
Serat kasar adalah residu dari bahan makanan atau pertanian setelah diperlakukan dengan asam atau alkali mendidih Fardiaz, et al., 1986.
dalam Sudiaman, 1990. Kadar serat kasar pati sagu mencapai 0.02.
Nilai kadar serat kasar pati sagu yang digunakan dalam penelitian ini kecil karena adanya proses pengayakan. Kadar serat kasar yang tinggi dapat
menurunkan efisiensi proses hidrolisis dan mempengaruhi kerja enzim sehingga perlu adanya penambahan dosis enzim.
Kadar pati merupakan sifat fisik yang berpengaruh terhadap pembuatan sirup glukosa. Kadar pati sagu yang digunakan adalah 82.15.
Pati memiliki dua komponen yaitu amilosa dan amilopektin. Kadar amilosa yang terdapat pada pati sagu adalah sebesar 27.71 dan kadar
amilopektin sebesar 72.29. Rasio amilosa dan amilopektin berpengaruh pada jumlah dosis enzim yang ditambahkan. Ikatan -1,6 glikosidik yang
terdapat pada amilopektin dapat dihidrolisis oleh amiloglukosidase sedangkan ikatan -1,4 glikosidik hanya akan dipotong oleh amilase.
Enzim yang digunakan pada tahap likuifikasi adalah -amilase dengan aktivitas 5.574 Uml. Satu unit enzim -amilase adalah 1 µmol produk
yang terbentuk dalam 1 menit. Sementara itu pada proses sakarifikasi
digunakan enzim amiloglukosidase dengan aktivitas 8.931 Uml. Jumlah ml enzim yang digunakan dalam produksi hidrolisat pati sagu dapat
ditentukan dari aktivitas enzim tersebut. Neraca massa produksi hidrolisat pati sagu dapat dilihat pada
Lampiran 8. Analisa hidrolisat pati sagu yang dilakukan meliputi kadar gula total,
kadar gula pereduksi, Dektrose Ekuivalen DE, Derajat Polimerisasi DP serta pH. Dari hidrolisis pati sagu dihasilkan nilai gula pereduksi 352.6 gl,
total gula 496.6 gl. Nilai DP hidrolisat pati sagu adalah 1.4 dan nilai DE hidrolisat adalah 98.9. Hidrolisat pati sagu yang dihasilkan memiliki pH
6.10. Ekuivalen dektrosa merupakan rasio gula pereduksi hidrolisat
dengan gula pereduksi hidrolisis sempurna. Gula pereduksi yang dihasilkan sebagai persen D-glukosa yaitu 35.26 bv. Nilai ekuivalen
dekstrosa yang diperoleh dari sirup glukosa adalah sekitar 98,8 bv. Tingginya nilai ekuivalen dekstrosa disebabkan karena semakin
banyaknya pati yang terkonversi menjadi glukosa. Derajat Keasaman pH hidrolisat pati sagu adalah sebesar 6.12. Pada penelitian Akyuni 2004
dihasilkan nilai pH 7.01. Hal ini disebabkan karena pada penelitian tersebut dilakukan penyaringan menggunakan arang aktif. Sementara itu
pada penelitian ini tidak dilakukan penyaringan menggunakan arang aktif.
b. Pemilihan Metoda Penyiapan Inokulum Ragi Roti
Hasil penghitungan sel dan metode persiapan inokulum pada ragi roti dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 memperlihatkan bahwa 0.1 gram ragi roti memiliki jumlah sel yang hampir sama dengan inokulum menggunakan 1 ose Saccharomyces
cerevisiae yaitu 7.97 10
4
selml inokulum. Selanjutnya pada penelitian ini dilakukan fermentasi menggunakan ragi roti sebanyak 0.1 gram yang
dilarutkan pada media air yang bersuhu 30
o
C.
Tabel 2. Perhitungan sel dan metode inkubasi inokulum. Jenis Inokulum
Gramvolume media Jumlah sel
Saccharomyces cerevisiae
kultur murni 1 ose20 ml GYE
8.0 10
4
sel ml inokulum
Ragi roti 1 gram20 ml GYE
7.9 10
5
sel ml inokulum
Ragi roti 0.1 gram20 ml GYE
7.93 10
4
sel ml inokulum
Ragi roti 0.1 gram20 ml air 30
o
C 7.97 10
4
sel ml inokulum
B. PENELITIAN UTAMA
Kategori