Amiloglukosidase yang umumnya digunakan pada tahap sakarifikasi berasal dari Aspergillus niger. Pada kondisi yang sesuai, enzim
amiloglukosidase ditambahkan dengan dosis berkisar 1.65-0.80 liter enzim per ton pati dengan dosis sebesar 200 Ukg pati Chaplin dan Buckle, 1990.
Amiloglukosidae yang berasal dari Novo yaitu AMG tersedia dalam bentuk cair dengan aktivitas 200, 300 atau 400 AGU g
-1
. Satu AGU Amiloglukosidase Unit adalah jumlah enzim yang menghidrolisis 1
µmol maltosa per menit pada suhu 25
o
C dan kondisi standar Kearsley dan Dziedzic, 1995.
C. FERMENTASI ETANOL
Menururt Prescot dan Dunn 1959, etanol dapat diproduksi dari gula melalui fermentasi pada kondisi tertentu. Sedangkan pati dan karbohidrat
lainnya dapat dihidrolisa menjadi gula kemudian difermentasi untuk membentuk etanol. Etanol merupakan nama kimia untuk alkohol dengan
rumus kimia C
2
H
5
OH. Bioetanol adalah cairan biokimia dari proses fermentasi
gula dari
sumber karbohidrat
menggunakan bantuan
mikroorganisme. Proses produksi etanol berbahan baku karbohidrat dapat dilihat pada Lampiran 1.
Mikroorganisme yang dipakai dalam fermentasi etanol adalah khamir. Khamir yang biasa digunakan untuk menghasilkan etanol adalah
Saccharomyces cerevisiae . Saccharomyces cerevisiae sering dipakai pada
fermentasi etanol karena menghasilkan etanol yang tinggi, toleran terhadap kadar etanol yang tinggi, mampu hidup pada suhu tinggi, tetap stabil selama
kondisi fermentasi dan dapat bertahan hidup pada pH rendah Rehm dan Reed, 1981.
Saccharomyces cerevisiae bisa didapatkan dalam bentuk kultur murni
maupun dalam bentuk ragi. Menurut Peppler 1973 Saccharomyces cerevisiae
bisa diproduksi menjadi ragi, baik untuk pembuatan roti baker’s yeast
ataupun pada pembuatan minuman beralkohol brewing yeast dan wine yeast
. Kultur Saccharomyces cerevisiae yang berbeda memiliki sifat dan karakteristik yang berbeda Cofalec, 2006. Pada pembuatan ragi roti
digunakan Saccharomyces cerevisiae yang memiliki sifat antara lain menghasilkan karbondioksida yang tinggi serta mampu memberikan tekstur
dan rasa roti yang baik. Sementara Saccharomyces cerevisiae yang digunakan untuk produksi alkohol memiliki sifat antara lain mampu menghasilkan etanol
yang tinggi Peppler 1989. Ragi roti mengandung sel hidup viable cell Saccharomyces cerevisiae
Retledge, 2001. Ragi roti biasanya berbentuk kering dengan berat kering 95 atau bentuk basah dengan berat kering 25-29. Ragi roti biasanya
digunakan sebagai zat pengembang adonan dan untuk memberikan tekstur serta rasa yang khas pada roti. Sementara itu ragi pada minuman beralkohol
brewing yeast dan wine yeast digunakan sebagai inokulum pada pembuatan minuman beralkohol. Menurut Peppler 1979 ragi yang paling banyak
digunakan dan tersedia banyak di pasaran adalah ragi roti. Galur Saccharomyces cerevisiae
yang digunakan berbeda antara ragi roti dan ragi untuk industri alkohol Retledge, 2001.
Khamir memerlukan medium dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan dan perkembang-biakannya. Unsur-unsur dasar yang dibutuhkan
adalah karbon, hidrogen, oksigen, fosfor, zat besi dan magnesium. Unsur karbon banyak diperoleh dari dari gula, sumber nitrogen didapatkan dari
amonia, asam amino, peptida, pepton, nitrat atau urea tergantung pada jenis khamir. Fosfor merupakan unsur penting dalam kehidupan khamir terutama
dari pembentukan alkohol dari gula. Pada permulaan proses fermentasi, khamir memerlukan oksigen untuk
pertumbuhannya sehingga fermentasi terjadi secara aerob. Setelah terbentuk CO
2
, reaksi akan berubah menjadi anaerob. Alkohol yang terbentuk akan
menghalangi fermentasi lebih lanjut setelah tercapai konsentrasi antara 13- 15 volume. Konsentrasi alkohol akan menghalangi fermentasi tergantung
pada suhu dan jenis khamir yang digunakan Prescot dan Dunn, 1959. Khamir tumbuh terbaik pada kondisi aerobik, walaupun demikian
beberapa khamir dapat tumbuh pada kondisi anaerobik. Proses respirasi pada kondisi aerobik selanjutnya digantikan proses fermentasi pada kondisi
anaerobik karena tidak tersedia lagi oksigen. Khamir akan selalu berespirasi
pada setiap keadaan yang memungkinkan karena energi yang dihasilkan pada respirasi jauh lebih besar dibandingkan energi yang dihasilkan pada
fermentasi Barnett et al., 2000. Bila terdapat udara pada proses fermentasi maka etanol yang dihasilkan lebih sedikit karena terjadi respirasi yang
mengakibatkan terjadinya konversi gula menjadi karbondioksida dan air. Suhu optimum pertumbuhan khamir adalah pada suhu 25
o
-30
o
C dan maksimum pada 35
o
C-47
o
C. Sedangkan pH optimum adalah 4-5. Batas minimal a
w
untuk khamir biasa adalah 0.88-0.94 sedangkan untuk khamir osmofilik dapat tumbuh pada a
w
yang lebih rendah yaitu sekitar 0.32-0.65. Namun demikian banyak juga khamir osmofilik yang pertumbuhannya
terhenti pada a
w
0.78 seperti pada larutan garam ataupun sirup Frazier dan Westhoff, 1978.
Menurut Casida 1968 pH pertumbuhan khamir yang baik adalah pada rentang antara 3-6. Perubahan pH dapat mempengaruhi pembentukan hasil
samping fermentasi. Nilai pH pertumbuhan berhubungan positif dengan pembentukan asam piruvat. Pada pH tinggi maka lag fase akan lebih singkat
dan aktifitas fermentasi akan meningkat. Pengaruh pH pada pertumbuhan khamir juga tergantung pada konsentrasi gula dan etanol. Nilai pH dapat
diturunkan menggunakan asam sitrat, sedangkan untuk menaikkan pH dapat digunakan natrium benzoat.
Paturau 1981 menyatakan bahwa fermentasi etanol memakan waktu 30- 72 jam. Prescott dan Dunn 1959 menyatakan bahwa waktu fermentasi etanol
adalah 3-7 hari. Amerine dan Cruess 1960 menyatakan bahwa proses pemecahan gula
menjadi etanol dan CO
2
dilakukan oleh sel khamir. Enzim yang berperan dalam
pembuatan etanol
dari glukosa
adalah heksosinase,
fosfoheksoisomerase, fosfofruktokinase, aldose, triosefosfat isomerase, gliseraldehid 3 fosfat dehydrogenase, fosfogliserokinase, piruvat karboksilase
dan alkohol dehidrogenase.
Secara teoritis konversi molekul gula menjadi 2 molekul etanol dan 2 molekul CO
2
menururt persamaan Gay Lussac sebagai berikut C
6
H
12
O
6
2 C
2
H
5
OH + 2 CO
2
gula etanol karbondioksida
Berdasarkan persamaan di atas dapat dijelaskan bahwa 51,1 gula diubah menjadi etanol dan 49.9 diubah menjadi karbondioksida. Akan tetapi hasil
ini kebanyakan tidak dapat dicapai karena adanya hasil sampingan. Pada kenyataannya hanya 90-95 dari nilai ini yang dapat dicapai. Konsentrasi
alkohol yang dihasilkan dalam fermentasi tergantung pada jenis khamir yang dipakai dan kadar gula. Sedangkan konsentrasi produk samping dipengaruhi
oleh suhu, aerasi, kadar gula dan keasaman Underkofler dan Hickey, 1954. Produk samping yang dihasilkan antara lain asam piruvat dan asam laktat.
Pada kondisi anaerob, metabolisme glukosa menjadi etanol melalui jalur Embden Meyerhoff-Parnas yang merupakan reaki-reaksi fosforilasi dan
defosforilasi dengan ATP dan ADP sebagai donor aseptor fosfat, reaksi pemecahan C
6
menjadi 2 molekul C
3
yang terforforilasi, reaksi oksidasi- reduksi dan reaksi dekarboksilasi. Skema Embden Meyerhoff-Parnas Pathway
dapat dilihat pada Gambar 1. Glukosa mengalami fosforilasi menjadi glukosa-6-P dan fruktosa-6-P
dengan ATP sebagai donor fosfat. Fruktosa-6-P kemudian diubah menjadi fruktosa 1,6-di-P menggunakan ATP sebagai donor fosfat. Fruktosa-1,6-di-P
kemudian dipecah menjadi dua molekul C
3
yang terfosforilasi yaitu dihidroksiaseton fosfat dan gliseraldehida-3-P. Dihidroksi aseton fosfat
selanjutnya teroksidasi menjadi gliserolfosfat kemudian diubah menjadi gliserol yang merupakan metabolit sekunder. Gliseraldehid-3-P tereduksi
membentuk asam 1,3-di-fosfogliserat kemudian mengalami defosforilasi menjadi 3-P-asam gliserat dengan melepaskan fosfat dan aseptor fosfat ADP
membentuk ATP. Selanjutnya, 3-P-asam gliserat membentuk 2-P-asam gliserat kemudian terbentuk asam fosfoenol piruvat dengan menghasilkan
ATP. Melalui reaksi dekarboksilasi, asam piruvat akan membentuk
asetaldehid dan CO
2
yang kemudian akan mengalami reaksi oksidasi membentuk etanol.
Gambar 1. Skema Embden Meyerhoff-Parnas Pathway Prescott dan Dunn, 1959.
ATP ADP
ATP ADP Glukosa
Glukosa-6-P Fruktosa-6-P
Fruktosa-1,6-Di-P NADH+H
+
NAD
+
1.3-Di-P-Asam Gliserat
ATP ADP
H
2
O 3-P-Asam Gliserat
2-P-Asam Gliserat Fenol-Asam-Piruvat
CO
2
NAD
+
NADH+H
+
Asam Piruvat Etanol Asetaldehida
Keterangan : ATP = Adenosin Trifosfat
ADP = Adenin Difosfat
NAD = Nikotinamida Adenin Dinukleotida
NADP = Nikotinamida Adenin Dinukleotida Fosfat NADPH = Nikotinamida Adenin Dinukleotida Tereduksi
Dihidroksi- aseton-Fosfat
Gliseraldehid-3-P
Glukosa mengalami fosforilasi menjadi glukosa-6-P dan fruktosa-6-P dengan ATP sebagai donor fosfat. Fruktosa-6-P kemudian diubah menjadi
fruktosa 1,6-di-P menggunakan ATP sebagai donor fosfat. Fruktosa-1,6-di-P kemudian dipecah menjadi dua molekul C
3
yang terfosforilasi yaitu dihidroksiaseton fosfat dan gliseraldehida-3-P. Dihidroksi aseton fosfat
selanjutnya teroksidasi menjadi gliserolfosfat kemudian diubah menjadi gliserol yang merupakan metabolit sekunder. Gliseraldehid-3-P tereduksi
membentuk asam 1,3-di-fosfogliserat kemudian mengalami defosforilasi menjadi 3-P-asam gliserat dengan melepaskan fosfat dan aseptor fosfat ADP
membentuk ATP. Selanjutnya, 3-P-asam gliserat membentuk 2-P-asam gliserat kemudian terbentuk asam fosfoenol piruvat dengan menghasilkan
ATP. Melalui reaksi dekarboksilasi, asam piruvat akan membentuk asetaldehid dan CO
2
yang kemudian akan mengalami reaksi oksidasi membentuk etanol.
Penambahan inokulum khamir dapat dilakukan dalam berbagai bentuk diantaranya dalam bentuk suspensi atau dalam bentuk kering. Banyaknya
suspensi khamir yang ditambahkan dalam fermentasi skala besar adalah sekitar 1-3 Prescott dan Dunn, 1959. Menurut Undekofler dan Hickey
1954 paling sedikit penambahan inokulum aktif pada pembuatan anggur adalah sekitar 1 apabila substrat yang digunakan bersih dan bebas dari
khamir yang tidak diinginkan. Sementara itu, Rinaldy 1987 menggunakan konsentrasi inokulum 10 vv.
Komposisi media untuk setiap mikroba berbeda satu sama lain. Zat makanan utama bagi pertumbuhan mikroba adalah sumber karbon, nitrogen
dan mineral terutama fosfat Casida,1968. Pertumbuhan mikrobial dipengaruhi oleh konsentrasi komponen penyusun media pertumbuhannya.
Pasokan sumber karbon merupakan faktor yang sangat berpengaruh pada pertumbuhan optimal, tetapi pada kenyataannya konsentrasi sumber karbon
mempunyai batas maksimum. Jika konsentrasi sumber karbon melampaui batas maka laju pertumbuhan akan terhambat Said, 1987
Dalam fermentasi skala industri, sumber karbon yang biasanya digunakan adalah karbohidrat yang dapat diperoleh dari berbagai jenis pati seperti
jagung, serelia, kentang dan sagu. Sumber karbon lain juga bisa didapatkan dari hasil pertanian yang banyak mengandung selulosa antara lain jerami padi,
tongkol jagung, bagas, limbah kayu dan kertas. Sebelum digunakan, bahan- bahan tersebut harus dihidrolisis lebih dulu baik secara kimia maupun secara
enzimatis Hartoto, 1992. Sumber nitrogen yang dapat digunakan dalam proses fermentasi
diantaranya corn step liquor, ekstrak gandum atau tauge, hidrolisat kasein, dan ekstrak khamir. Vogel 1983 membedakan sumber nitrogen menjadi
sumber organik dan anorganik. Yang termasuk sumber nitrogen organik adalah corn steep liquor, urea, protein, ekstrak khamir dan tepung ikan,
sedangkan sumber nitrogen anorganik adalah gas amonia, amonium hidroksida dan amonium sulfat.
Menurut Hartoto 1992 sumber nitrogen yang biasa digunakan untuk fermentasi skala besar adalah garam amonium, urea atau amonia. Pemilihan
ammonium sebagai sumber nitrogen disebabkan oleh faktor ekonomis yaitu harga yang relatif murah dan mudah didapatkan. Pupuk NPK dan ZA
mempunyai harga yang relatif murah dan mudah didapatkan.
D. KINETIKA FERMENTASI
