Tabel 3. Buffer reaksi optimum enzim restriksi Pingoud et al., 1993 Nama
enzim pH
optimum Jenis dan
konsentrasi garam
Suhu optimum
Keterangan Aha
I 8.0 KCl 150
mM 37
o
C KCl dapat
digantikan oleh NaCl
Bam HI 7.9 NaCl
100 mM 37
o
C Konsentrasi garam
100 mM menurunkan
aktivitas Eco
RI 7.5 NaCl 50
mM 37
o
C Konsentrasi garam
50 mM menginduksi star
activity Hind
III 8.0 NaCl 50
mM 37
o
C Konsentrasi garam
50 mM dan 100 mM menurunkan
aktivitas Mbo
II 7.4 KCl
10 mM 37
o
C Tidak sensitif
terhadap konsentrasi garam
Taq I 8.4 NaCl
100 mM 65
o
C Aktivitas pada 37
o
C setengah kali
aktivitas pada 65
o
C Xho
I 8.0 NaCl 150
mM 37
o
C Membutuhkan 0.01 Triton
E. DETEKSI AKTIVITAS ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI
1. Digesti
Kemampuan enzim endonuklease restriksi untuk mengenali dan memotong pada situs tertentu dapat dibuktikan dengan mereaksikan enzim
tersebut dengan substrat DNA digesti. Substrat DNA akan mengalami pemotongan jika terdapat sekuens yang sesuai dengan sekuens spesifik
enzim restriksi. Pengujian aktivitas restriksi enzim dilakukan dengan mereaksikan enzim dengan dua macam substrat DNA, yaitu DNA plasmid
dan DNA fage lambda, dalam kondisi reaksi yang dioptimalkan dengan penambahan buffer reaksi.
a. Plasmid sebagai substrat
DNA plasmid adalah DNA sirkuler berutas ganda yang terdapat dalam suatu bakteri sebagai DNA ekstrakromosomal yang independen
dan dapat bereplikasi sendiri Glick dan Pasternak, 2003. Ukuran plasmid beragam mulai dari 1 kpb sampai lebih dari 500 kpb. Plasmid
memiliki beberapa fenotipe, yaitu resisten terhadap antibiotik tertentu, memproduksi antibiotik, mendegradasi senyawa organik kompleks,
produksi kolisin dan enterotoksin, dan modifikasi atau restriksi oleh enzim Old dan Primrose, 1989. Suatu plasmid dapat dipotong oleh
enzim restriksi karena adanya situs pengenalan dan pemotongan oleh enzim restriksi dalam suatu plasmid. Menurut Lehninger 1982,
plasmid memiliki dua sifat istimewa yaitu dapat melewati sel pindah dari satu sel ke sel lain dan dapat bersatu dengan gen asing secara
mudah serta dapat diangkut ke dalam sel bakteri. Umumnya plasmid berbentuk molekul DNA sirkuler berutas
ganda. Jika kedua utas berupa lingkaran utuh, molekulnya digambarkan sebagai CCC Covalently Closed Circular DNA yang
berarti lingkaran tertutup kovalen. Apabila hanya satu utas yang utuh, molekulnya digambarkan sebagai OC DNA atau lingkaran terbuka
open circular. Ketika diisolasi dari sel, CCC memiliki defisiensi lengkungan pada heliks rangkap sehingga terbentuk konfigurasi
kumparan terpilin superkoil Old dan Primrose, 1989. Perbedaan konfigurasi struktural menyebabkan OC DNA terpisah
pada elektroforesis dengan agarosa. Bentuk DNA superkoil memiliki pergerakan tercepat. Plasmid yang memiliki satu situs pemotongan
akan mengalami perubahan bentuk jika terpotong. Menurut Roberts dan Halford 1993, pemotongan yang kurang sempurna akan
menghasilkan bentuk OC DNA yang menyertai bentuk linier. Pada hasil elektroforesis, plasmid OC akan mengalami pergerakan terlambat
sehingga jika ketiga konformasi plasmid dielektroforesis bersama, plasmid superkoil akan bergerak paling cepat, diikuti plasmid linier
dan plasmid OC Brown, 1990.
Plasmid pUC 19 merupakan salah satu plasmid rekombinan yang sering digunakan dalam rekayasa genetika. Plasmid ini memiliki copy
number yang tinggi 500-700 dan ukuran yang relatif kecil 2686 pb
Yanisch-Perron, 1985. Pembawa carrier plasmid pUC 19 adalah E.coli
sehingga plasmid harus diisolasi terlebih dahulu dari sel E.coli untuk memperoleh plasmid. Plasmid ini memiliki gen tahan terhadap
antibiotik ampisilin sehingga media pertumbuhan E.coli carrier plasmid pUC 19 harus ditambahkan ampisilin.
Gambar 3. Peta restriksi plasmid pUC 19 Yanisch-Perron, 1985
b. DNA fage lambda sebagai substrat
DNA fage lambda merupakan salah satu DNA yang paling banyak digunakan sebagai vektor dalam kloning karena sekuensnya
tidak analog dengan DNA kromosomal. DNA ini memiliki banyak situs yang dapat dikenali dan dipotong oleh sebagian besar enzim
restriksi. Ukuran DNA fage lambda cukup besar, yaitu 48.502 pb. Ujung-ujung utas ganda liniernya adalah ujung menggantung 5’
sebanyak 12 pb yang bersifat komplementer Old dan Primrose, 1989.
Banyaknya situs yang dapat dikenali oleh enzim restriksi memungkinkan penggunaan DNA fage lambda untuk deteksi aktivitas
restriksi yang mungkin dimiliki oleh enzim yang baru ditemukan. Digesti menggunakan DNA fage lambda dapat dilakukan pada awal
deteksi maupun akhir setelah deteksi aktivitas restriksi enzim dengan menggunakan substrat plasmid. Ukuran DNA fage lambda cukup
besar sehingga sangat memungkinkan enzim-enzim restriksi jenis baru untuk memotong sekuens DNA sesuai dengan situs pengenalan dan
pemotongan enzim.
Gambar 4. Peta restriksi DNA fage lambda Daniels, 1983
2. Elektroforesis Agarosa
