5. Waktu Reaksi
Lamanya waktu reaksi enzim ditentukan oleh unit aktivitas enzim. Enzim yang memiliki unit aktivitas tinggi tidak membutuhkan waktu
reaksi yang terlalu lama. Satu unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk memotong digest 1
μg DNA fage lambda dalam waktu 1 jam dengan total volume reaksi sebesar 50
μl Sambrook et al., 1989. Penggunaan enzim dalam jumlah yang lebih sedikit dimungkinkan
dengan memperpanjang waktu reaksi. Hal tersebut tidak akan menimbulkan masalah kecuali jika terdapat kontaminasi nuklease lainnya
Pingoud et al., 1993.
6. Aditif Penstabil
Enzim restriksi juga memiliki kebutuhan akan aditif penstabil untuk mencegah terjadinya oksidasi residu sistein. Aditif yang umum digunakan
adalah 1,4-dithiothreitol, 1,4-dithioeritritol, atau β-merkaptoetanol. Selain
itu, aditif juga berfungsi mencegah terjadinya agregasi dan presipitasi. Dalam hal ini, aditif yang umum digunakan adalah Tween, Lubrol, Triton
X-100, deterjen lainnya, atau Bovine Serum Albumin BSA Pingoud et al.,
1993. Menurut Davis et al.1986, faktor-faktor lain yang berhubungan dengan
kondisi-kondisi reaksi seperti kemurnian DNA dan keadaan enzim itu sendiri juga mempengaruhi aktivitas enzim. Metilasi DNA, ikatan dengan protein atau
kekentalan yang berlebihan dari DNA berberat molekul tinggi dalam larutan yang pekat dapat menurunkan efisiensi pemotongan oleh enzim. Pada
umumnya, DNA yang dipotong harus bebas dari pengotor. Adanya RNA dan DNA utas tunggal tidak berpengaruh buruk terhadap aktivitas enzim restriksi.
Kondisi buffer reaksi optimum untuk beberapa jenis enzim endonuklease restriksi dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Buffer reaksi optimum enzim restriksi Pingoud et al., 1993 Nama
enzim pH
optimum Jenis dan
konsentrasi garam
Suhu optimum
Keterangan Aha
I 8.0 KCl 150
mM 37
o
C KCl dapat
digantikan oleh NaCl
Bam HI 7.9 NaCl
100 mM 37
o
C Konsentrasi garam
100 mM menurunkan
aktivitas Eco
RI 7.5 NaCl 50
mM 37
o
C Konsentrasi garam
50 mM menginduksi star
activity Hind
III 8.0 NaCl 50
mM 37
o
C Konsentrasi garam
50 mM dan 100 mM menurunkan
aktivitas Mbo
II 7.4 KCl
10 mM 37
o
C Tidak sensitif
terhadap konsentrasi garam
Taq I 8.4 NaCl
100 mM 65
o
C Aktivitas pada 37
o
C setengah kali
aktivitas pada 65
o
C Xho
I 8.0 NaCl 150
mM 37
o
C Membutuhkan 0.01 Triton
E. DETEKSI AKTIVITAS ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI
1. Digesti
Kategori