B. ALAT
Alat-alat yang digunakan adalah sentrifus mikro berpendingin Tommy, eppendorf, tips, pipet mikro, sonikator soniprep-150, shaker, neraca analitik,
pH meter, otoklaf, refrigerator, freezer -20
o
C, vorteks, perangkat elektroforesis, UV-transilluminator, Gene Evaporator, dan alat-alat gelas.
C. METODE PENELITIAN 1.
Penumbuhan Kultur Bakteri
Isolat bakteri yang ada disegarkan kembali dengan cara digoreskan pada media padat Luria Bertani LB Agar kemudian dilihat apakah ada
kontaminasi kultur. Koloni yang tumbuh pada media padat tersebut diambil satu ose dan diinokulasikan pada media LB cair pembuatan sub
kultur. Media yang telah ditumbuhi bakteri tersebut kemudian ditambahkan pada media cair produksi untuk produksi sel bakteri. Media
cair media produksi sel bakteri yang telah diinokulasi tersebut diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1-2 hari.
2. Kultivasi Sel
Media LB yang telah diinkubasi tersebut dipindahkan ke dalam eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Pelet sel pada bagian bawah tabung dikumpulkan,
sedangkan cairan supernatan dibuang. Kultivasi sel Rhodobacter sp tidak dilakukan karena peneliti sudah menerima dalam bentuk pelet sel.
3. Pemecahan Membran Sel Rusli, 2006
Pelet sel yang terkumpul disuspensikan dengan buffer sonikasi yang terdiri dari Tris-HCl 10 mM pH 7.5, Na
2
EDTA 1 mM, dan β-
merkaptoetanol 7 mM. Suspensi bakteri tersebut disonikasi diskontinu, yaitu sonikasi selama 30 detik sebanyak 4 x yang diselingi istirahat selama
2 menit di antara setiap ulangan dengan amplitudo 15-16 μm. Selama
sonikasi, tabung yang berisi suspensi bakteri direndam dalam wadah berisi es untuk menjaga agar suhu suspensi tetap di bawah 10
o
C.
Suspensi bakteri yang telah disonikasi dipindahkan ke dalam beberapa tabung mikro steril dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm pada suhu 4
o
C selama 30 menit untuk mengendapkan sel-sel debris. Supernatan yang terbentuk mengandung enzim restriksi dan akan
digunakan dalam proses ekstraksi.
4. Ekstraksi Enzim Restriksi Rusli, 2006
Ke dalam tabung mikro steril diisikan 255 μl akuabides steril, 45 μl
NaCl 2 M, dan 300 μl polimer konsentrat. Tabung mikro yang berisi
campuran tersebut dimasukkan ke dalam wadah yang berisi es agar suhunya menjadi sekitar 4
o
C. Sebanyak 600 μl supernatan hasil
sentrifugasi ditambahkan ke dalam campuran dan divorteks secara diskontinu, yaitu divorteks selama 1-2 detik sebanyak 10 kali. Di antara
setiap ulangan, tabung dimasukkan ke dalam es sehingga suhunya dapat dipertahankan sekitar 4
o
C. Kemudian campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4
o
C selama 15 menit untuk mengendapkan asam nukleat. Enzim restriksi yang diinginkan berada pada
bagian supernatan. Ekstraksi diulangi kembali dengan cara menambahkan 300
μl polimer konsentrat ke dalam tabung mikro steril dan dimasukkan ke
dalam es. Sebanyak 900 μl cairan supernatan hasil sentrifugasi pada
ekstraksi tahap pertama ditambahkan ke dalam tabung mikro tersebut. Campuran divorteks secara diskontinu dan disentrifugasi pada kondisi
yang sama dengan ekstraksi tahap pertama. Tahap ekstraksi dengan polimer konsentrat dapat diulangi dengan cara yang sama. Enzim restriksi
pada bagian supernatan dapat diuji aktivitasnya.
5. Isolasi Plasmid
