memiliki dua buah domain, yaitu domain pengikatan DNA dan domain pemotongan DNA. Contohnya adalah enzim FokI Pingoud et al., 1993.
Subtipe enzim restriksi yang berbeda dengan enzim subtipe lainnya adalah enzim tipe IIm. Enzim ini dapat mengenali DNA yang termetilasi.
Aktivitas ini dimiliki oleh enzim BisI yang diteliti oleh Chmusz et al. 2005 dan GlaI yang diteliti oleh Chernukin et al. 2005. Kedua enzim ini
memotong sekuens spesifik pada DNA yang termetilasi, yaitu sekuens 5’-G 5mc NGC-3’ untuk BisI dan 5’-Gm5c GC-3’ untuk GlaI. Enzim-enzim
yang memiliki karakteristik unik ini diduga terlibat dalam tahap proteksi sel bakteri terhadap infeksi dari DNA bakteriofage yang termetilasi.
D. KARAKTERISTIK ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI
Enzim restriksi membutuhkan kondisi tertentu untuk menghasilkan aktivitas pemotongan yang optimum, seperti suhu, pH, kekuatan ionik, ion
Mg
2+
, waktu reaksi, dan aditif penstabil Pingoud et al., 1993. Setiap parameter tersebut mempengaruhi kondisi reaksi optimum pemotongan
substrat DNA oleh enzim.
1. Suhu
Suhu optimum suatu enzim adalah suhu dimana aktivitas enzim dapat menjadi maksimum. Peningkatan suhu dapat menyebabkan kenaikan
laju reaksi enzim karena bertambahnya energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi enzim dengan substrat. Hal tersebut
memperbesar peluang enzim untuk bereaksi Suhartono, 1989. Suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan inaktivasi enzim. Suhu yang terlalu
tinggi juga dapat mempercepat pemecahan atau kerusakan enzim karena denaturasi protein enzim pada suhu tinggi.
Sebagian besar enzim endonuklease restriksi memiliki suhu optimum sekitar 37
o
C. Beberapa enzim restriksi yang diperoleh dari bakteri thermofilik memiliki aktivitas pemotongan optimum pada suhu tinggi
Pingoud et al., 1993.
2. pH
Semua reaksi enzim dipengaruhi pH medium tempat reaksi terjadi sehingga diperlukan buffer untuk mengontrol pH reaksi. Pada umumnya,
enzim aktif pada pH netral, yaitu pH cairan mahluk hidup. Namun, kisaran kereaktifan enzim dapat mencapai pH 5-9 Suhartono, 1989. Menurut
Pingoud et al. 1993, hampir semua enzim restriksi bekerja dengan baik pada kisaran pH 7.2-8.0.
3. Kekuatan Ionik
Kekuatan ionik mempengaruhi aktivitas suatu enzim. Keakuratan dan aktivitas enzim restriksi sangat dipengaruhi oleh kekuatan ionik.
Penambahan garam KCl atau NaCl ke dalam buffer Tris-HCl dapat dilakukan untuk mengatur kekuatan ionik. Konsentrasi garam dan
kekuatan ionik yang tepat sangat diperlukan karena kekuatan ionik yang rendah akan menginduksi aktivitas bintang dan kekuatan ionik yang terlalu
tinggi akan mengaktivasi endonuklease non spesifik kontaminan atau menghambat enzim restriksi itu sendiri. Hampir semua enzim restriksi
dapat menerima kekuatan ionik dari NaCl 50-150 mM maupun KCl 10- 150 mM, namun beberapa enzim restriksi hanya aktif pada kekuatan ionik
yang diberikan oleh KCl, seperti enzim SmaI Pingoud et al., 1993.
4. Pengaruh Kation
Beberapa enzim hanya terdiri dari polipeptida dan tidak mengandung gugus kimiawi selain asam amino, seperti enzim ribonuklease pankreas.
Namun, enzim lain membutuhkan tambahan komponen kimia bagi aktivitasnya kofaktor. Kofaktor dapat berupa kation yang biasanya
merupakan ion-ion logam seperti Mg
2+
, Zn
2+
, Sn
2+
, dan Mn
2+
Lehninger, 1982.
Ketersediaan Ion Mg
2+
sangat penting bagi aktivitas enzim endonuklease restriksi. Ion Mg
2+
diduga berperan sebagai aktivator molekul air untuk membentuk nukleofil yang dibutuhkan atau untuk
menyebabkan polarisasi ikatan fosfodiester yang akan dipotong Pingoud et al.,
1993. Konsentrasi optimum sekitar 5-10 mM MgCl
2
.
5. Waktu Reaksi
