Suspensi bakteri yang telah disonikasi dipindahkan ke dalam beberapa tabung mikro steril dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000
rpm pada suhu 4
o
C selama 30 menit untuk mengendapkan sel-sel debris. Supernatan yang terbentuk mengandung enzim restriksi dan akan
digunakan dalam proses ekstraksi.
4. Ekstraksi Enzim Restriksi Rusli, 2006
Ke dalam tabung mikro steril diisikan 255 μl akuabides steril, 45 μl
NaCl 2 M, dan 300 μl polimer konsentrat. Tabung mikro yang berisi
campuran tersebut dimasukkan ke dalam wadah yang berisi es agar suhunya menjadi sekitar 4
o
C. Sebanyak 600 μl supernatan hasil
sentrifugasi ditambahkan ke dalam campuran dan divorteks secara diskontinu, yaitu divorteks selama 1-2 detik sebanyak 10 kali. Di antara
setiap ulangan, tabung dimasukkan ke dalam es sehingga suhunya dapat dipertahankan sekitar 4
o
C. Kemudian campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4
o
C selama 15 menit untuk mengendapkan asam nukleat. Enzim restriksi yang diinginkan berada pada
bagian supernatan. Ekstraksi diulangi kembali dengan cara menambahkan 300
μl polimer konsentrat ke dalam tabung mikro steril dan dimasukkan ke
dalam es. Sebanyak 900 μl cairan supernatan hasil sentrifugasi pada
ekstraksi tahap pertama ditambahkan ke dalam tabung mikro tersebut. Campuran divorteks secara diskontinu dan disentrifugasi pada kondisi
yang sama dengan ekstraksi tahap pertama. Tahap ekstraksi dengan polimer konsentrat dapat diulangi dengan cara yang sama. Enzim restriksi
pada bagian supernatan dapat diuji aktivitasnya.
5. Isolasi Plasmid
Sambrook et al., 1989 yang telah dimodifikasi
Kultur E.coli DH5 α pUC 19 ditumbuhkan selama semalam dalam 25
ml LB yang telah ditambahkan antibiotik ampisilin. Kultur dipelet dalam eppendorf dengan sentrifus mikro berkecepatan 12.000 rpm suhu 4
o
C selama 10 menit. Perlakuan tersebut diulangi hingga kultur habis. Pelet sel
diresuspensi dengan 150 μl Larutan 1 Tris-HCl 25 mM, glukosa 50 mM,
Na
2
EDTA 10 mM dingin kemudian divorteks. Larutan 2 NaOH 0.2 M, 1 SDS sebanyak 150
μl dibuat segar ditambahkan ke dalam campuran. Kemudian eppendorf dibolak-balik 5
kali secara cepat dan tidak divorteks. Lisis sel ditandai dengan terbentuknya cairan jernih dan kental. Lalu ke dalam campuran
ditambahkan 150 μl Larutan 3 NaAsetat 1.32 M yang ditambahkan asam
asetat hingga pH 4.8 dingin kemudian divorteks selama 10 detik. Selanjutnya, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 10 menit pada suhu 4
o
C, dan bagian supernatannya dipisahkan ke dalam eppendorf lain.
Supernatan tersebut ditambahkan PCI Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol – 25:24:1, divorteks selama 10 detik dan disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 20
o
C volume PCI yang ditambahkan sebanyak volume supernatan. Campuran akan membentuk
dua lapisan dan lapisan atas akan dipindahkan ke eppendorf steril lain dan dipresipitasi selama 2 jam dalam freezer dengan menambahkan etanol
absolut dan larutan Na-Asetat 3 MAsam asetat glasial pH 5.2. Setelah inkubasi selesai, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 20 menit pada suhu 4
o
C. Endapan yang terbentuk dibilas dengan etanol 70 kemudian dikeringkan dengan Gene Evaporator. Setelah
kering, pelet dilarutkan dalam buffer TE Tris-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM pH 8.0 bila ingin disimpan dalam freezer atau akuabides steril bila
ingin langsung dipakai.
6. Digesti Substrat DNA dan Plasmid
Digesti dilakukan dengan mencampurkan 16 μl ekstrak enzim, 2 μl
plasmid, dan 2 μl buffer reaksi stok 10x atau 16 μl ekstrak enzim, 2 μl
DNA fage lambda, dan 2 μl buffer reaksi stok 10x. Campuran tersebut
diinkubasi selama semalam over night digest selama 16 jam pada suhu 37
o
C.
7. Elektroforesis Gel Agarosa
