7. Elektroforesis Gel Agarosa
Rusli, 2006 Aktivitas pemotongan oleh enzim restriksi dihentikan dengan
memindahkan campuran enzim restriksi-substrat-buffer ke dalam freezer. Hasil reaksi diuji dengan elektroforesis gel agarosa 1 atau 0.8.
Sebanyak 0.25 g agarosa dicampur dengan 25 ml buffer TAE 1x untuk membuat gel kecil 1 atau 0.4 g agarosa dengan 40 ml buffer TAE 1x
untuk membuat gel besar. Campuran agarosa dan buffer TAE dipanaskan hingga mendidih dan
bening kemudian didinginkan sampai suhu 55-60
o
C, kemudian dituang ke dalam cetakan yang telah diberi sisir. Setelah gel membeku, sisirnya
diambil dan gel diletakkan dalam wadah elektroforesis. Wadah elektroforesis diisi dengan buffer TAE 1 x sampai gel berada +1 mm di
bawah permukaan cairan buffer. Sampel yang akan dianalisis ditambah dengan 2
μl blue juice. Sebanyak 20
μl sampel dimasukkan ke dalam sumur gel. Untuk menentukan ukuran fragmen, sebanyak 3
μl marker DNA 1kb juga dimasukkan ke dalam salah satu sumur gel. Pelindung ditutup dan alat
elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 V selama 30 menit. Setelah proses elektroforesis selesai, gel direndam dalam larutan
etidium bromida selama 15-20 menit untuk proses staining. Proses destaining
dilakukan dengan cara merendam gel dalam akuades selama 10-15 menit. Pita-pita DNA yang terbentuk diamati dengan UV-
transilluminator.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. EKSTRAKSI ENZIM RESTRIKSI
Ekstraksi enzim restriksi dari bakteri diawali dengan pemecahan membran sel lisis sel bakteri karena enzim restriksi merupakan enzim
intraseluler. Enzim intraseluler merupakan enzim yang disintesis oleh sel dan disekresikan dalam sel sehingga dibutuhkan pemecahan membran sel untuk
memperolehnya. Metode yang dapat digunakan untuk memecahkan membran sel bakteri cukup bervariasi. Menurut Suhartono 1989, pemecahan membran
sel dapat dilakukan dengan menggunakan cara-cara kimia dan fisik. Pemecahan secara kimiawi dapat dilakukan dengan menambahkan lisozim dan
deterjen sodium lauril sulfat dan Triton X 100. Lisozim terutama ditambahkan jika bakteri tersebut merupakan bakteri Gram positif. Pemecahan
secara fisik dapat dilakukan dengan metode sonikasi, French pressure, freeze thaw, hammer mill,
kejutan osmotik, dan homogenasi. Penambahan senyawa tertentu seperti bubuk alumina, pasir, dan silika juga sering dilakukan untuk
membantu pemecahan membran sel. Metode yang digunakan untuk isolasi enzim restriksi cukup bervariasi.
Yun et al.1995 menggunakan bead beater untuk melisis sel Streptomyces violochromogenes
D2-5 dan memperoleh enzim SviI. Lynn et al.1980 menggunakan French pressure untuk melisis sel Rhodopseudomonas
sphaeroides . Sel yang diresuspensikan buffer dengan perbandingan 1:2 wv
dihancurkan dengan menggunakan metode French pressure berkekuatan 20.000 lbin
2
. Lisis sel Anoxybacillus flavithermus dilakukan dengan menggunakan manik-manik gelas berdiameter 2 mm yang divorteks
diskontinu Sharma et al., 2003. Degtyarev et al.2007 menggunakan sonikasi diskontinu untuk melisis sel Pseudomonas species SE-G49 yang
menghasilkan enzim PsiI. Demikian juga dengan Welch dan Williams 1995 yang menggunakan sonikasi diskontinu untuk melisis sel Thermus sp. dan
Thermus SM49 untuk memperoleh enzim Tsp4CI dan Tsp49I. Sonikasi
kontinu dilakukan oleh Imber dan Bickle 1981 untuk melisis sel Bacillus globigii
dan memperoleh enzim BglII.
Metode pemecahan sel yang dilakukan dalam penelitian adalah metode sonikasi dengan menggunakan alat sonikator. Alat sonikator akan memberikan
getaran vibrasi dengan amplitudo tertentu dan frekuensi tinggi sehingga timbul gesekan mekanis pada membran sel dan membran sel akan hancur
Bollag dan Edelstein, 1991. Amplitudo yang digunakan adalah sebesar 15-16 μm.
Gesekan mekanis akan menimbulkan energi mekanis berupa panas yang dapat merusak enzim restriksi sehingga suhu suspensi sel harus dipertahankan
di bawah 10
o
C selama sonikasi. Suhu dapat dipertahankan dengan merendam wadah yang berisi suspensi sel dalam es. Selain itu, kenaikan suhu dapat
dicegah dengan melakukan sonikasi diskontinu, yaitu sonikasi yang diselingi istirahat selama dua menit diantara setiap ulangan sonikasi. Sonikasi yang
berlebihan dapat menghasilkan debris sel yang sangat halus sehingga mempersulit pemisahan enzim dari debris dengan cara sentrifugasi.
Berdasarkan penelitian Juliana 1996, Setiawan 1998, dan Rusli 2006, pengulangan sonikasi dilakukan sebanyak 4 kali untuk semua jenis
bakteri kecuali Pseudomonas sp.. Pengulangan sonikasi dilakukan sebanyak 6 kali karena membran sel belum sepenuhnya terpecah pada ulangan sonikasi
keempat Rusli, 2006. Hal tersebut dapat diamati dengan mengunakan mikroskop. Dengan demikian, tidak semua jenis bakteri membutuhkan
ulangan sonikasi yang sama karena sifat morfologi bakteri yang berbeda, misalnya penghasil lendir atau kapsul. Bakteri tersebut mungkin akan
membutuhkan pengulangan sonikasi yang lebih banyak untuk memastikan membran sel bakteri tersebut telah terpecah. Menurut Imber dan Bickle
1981, lisis sel Bacillus globigii dengan sonikasi membutuhkan waktu selama 5 menit untuk pelet sel sebanyak 250 gram, sedangkan pelet sel bakteri
Thermus sp. hanya membutuhkan sonikasi diskontinu 3 x 30 detik Welch dan
Williams, 1995. Waktu sonikasi yang digunakan untuk melisis sel Pseudomonas
species SE-G49 adalah 7 x 45 detik Degtyarev et al, 2007 Perbandingan metode-metode yang digunakan untuk melisis sel bakteri dalam
ekstraksi enzim endonuklease restriksi pada berbagai penelitian dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Metode lisis sel dalam ekstraksi enzim endonuklease restriksi
Organisme penghasil
Nama enzim
Metode lisis sel Komposisi buffer sonikasi
Pseudomonas species SE-G49
Degtyarev et al.,
2007 Psi
I Sonikasi diskontinu 7x,
45 detik 10 mM Tris-HCl
0.1 mM EDTA 7 mM
β-merkaptoetanol 1 mM phenylmethylsulfonyl
fluoride PMSF
0.01 Triton X-100 Bacillus globigii
Imber dan Bickle, 1981
Bgl II Sonikasi
kontinu 5 menit
20 mM Tris-HCl 0.1 mM EDTA
7 mM β-merkaptoetanol
pH 8.0 Anoxybacillus
flavithermus Sharma et al.,
2003 Bfl
I Vorteks diskontinu
dengan manik- manik gelas 5-
10x selama 1 menit
100 μgml lisozim
10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA
10 mM MgCl
2
5 mM β-merkaptoetanol
5 mM PMSF pH 8.0
Thermus sp. ;
Thermus SM49
Welch dan Williams 1995;
Ibid, 1996 Tsp
4CI Tsp
49I Sonikasi
diskontinu 3 x 30 detik
20 mM Tris-HCl 0.1 mM EDTA
2 mM dithiothreitol pH 7.6
Streptomyces violochromogenes
D2-5 Yun et al., 1995
Svi I
Bead beater 10 mM Potassium fosfat
10 mM β-merkaptoetanol
5 gliserol pH 6.5
Rhodopseudomonas sphaeroides
Lynn et al.,
1980 Rsa
I French pressure
20.000 lbin
2
10 mM Potassium fosfat 0.1 mM EDTA
10 mM β-merkaptoetanol
0.05 mM PMSF pH 7.4
Rhodobacter sphaeroides MW5 Juliana, 1996;
Setiawan, 1998 Sonikasi
diskontinu 4 x 30 detik
10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA
7 mM β-merkaptoetanol
pH 7.5 Isolat Xilanase negatif A
Rusli, 2006 Sonikasi
diskontinu 4 dan 6 x 30
detik 10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA 7 mM
β-merkaptoetanol pH 7.5
Penelitian ini Sonikasi
diskontinu 4 dan 6 x 30
detik 10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA 7 mM
β-merkaptoetanol pH 7.5
Pemecahan membran sel setelah sonikasi menyebabkan komponen intraseluler sel tidak terlindungi lagi, seperti protein-protein intrasel yang
mudah teroksidasi dan terdegradasi akibat aktivitas enzim protease ekstraseluler. Oksidasi juga dapat terjadi pada enzim, khususnya sisi aktif
enzim. Gugus sulfidril yang terdapat pada residu sistein dapat teroksidasi dan membentuk ikatan disulfida dengan gugus sulfidril lain. Hal tersebut dapat
menurunkan aktivitas enzim akibat kerusakan enzim. Proses oksidasi dapat terjadi karena adanya ion-ion logam atau ion divalen yang dapat mengaktifkan
molekul oksigen dan membentuk kompleks dengan gugus sulfidril. Proses oksidasi tersebut dapat dicegah dengan penambahan antioksidan
pada larutan resuspensi sel atau buffer sonikasi. Senyawa yang digunakan adalah
β-merkaptoetanol yang merupakan senyawa tiol. β-merkaptoetanol merupakan senyawa pereduksi yang berfungsi melindungi gugus sulfidril
enzim dari oksidasi dengan cara mereduksi ikatan disulfida. Dengan tereduksinya ikatan disulfida, sisi aktif enzim akan terlindungi dari reaksi
oksidasi. Konsentrasi β-merkaptoetanol dalam buffer sonikasi adalah 7 mM.
Menurut Rusli 2006, konsentrasi yang rendah akan mengakibatkan β-
merkaptoetanol teroksidasi dalam waktu singkat sehingga tidak mampu memberikan perlindungan lebih lama.
β-merkaptoetanol juga dapat berikatan dengan sisi aktif enzim sehingga mempercepat inaktivasi enzim yang
diekstrak. Alberts et al. 1983 juga menyebutkan bahwa β-merkaptoetanol
ditambahkan untuk merusak ikatan disulfida pada protein. Senyawa lain yang berfungsi sama dengan
β-merkaptoetanol adalah dithiothreitol dan dithioeritritol.
EDTA merupakan senyawa pengkelat yang dapat mengkelat ion-ion logam sehingga ion logam tidak membentuk kompleks dengan gugus sulfidril
pada sisi aktif enzim. Pengkelatan ion logam oleh EDTA akan menghambat reaksi oksidasi gugus sulfidril pada sisi aktif enzim. Selain itu, EDTA juga
dapat mengikat ion-ion divalen yang diperlukan untuk aktivitas enzim protease ekstraseluler sehingga mencegah degradasi proteolitik enzim restriksi
oleh enzim protease tersebut.
B. PEMISAHAN MATERI GENETIK BAKTERI
Ekstrak enzim yang diperoleh setelah sonikasi dipisahkan dari debris sel dengan sentrifugasi. Debris sel akan mengendap karena memiliki berat
molekul yang lebih besar daripada enzim restriksi sehingga ekstrak enzim akan berada pada bagian supernatan. Ekstrak enzim yang diperoleh
merupakan ekstrak enzim kasar. Ekstrak enzim tersebut dapat langsung digunakan untuk uji aktivitas, namun masih terdapat partikel pengotor seperti
materi genetik bakteri dan kontaminan nuklease spesifik lainnya. Enzim restriksi yang digunakan harus bebas dari DNA bakteri karena DNA bakteri
dapat berikatan dengan enzim restriksi inhibitor enzim. Selain itu, DNA bakteri yang tidak dipisahkan akan muncul sebagai fragmen-fragmen dalam
elektroforesis sehingga dapat menyebabkan kesalahan analisis hasil pemotongan enzim restriksi.
Metode yang digunakan untuk memisahkan protein adalah metode pemisahan dua fase. Menurut Frank 1993, makromolekul seperti protein dan
asam nukleat akan memisah berdasarkan struktur dan komposisi ionik dalam sistem fase. Sistem dua fase diperoleh dengan mencampurkan dua polimer
dalam air. Polimer yang dipelajari dan banyak digunakan adalah PEG dengan dekstran atau PEG dengan garam seperti kalium fosfat Kula 1979 dan
Albertsson 1986 di acu dalam Andrew dan Asenjo 1989. Penambahan polietilen glikol PEG akan menyebabkan terjadinya
hidrasi molekul air sehingga protein akan bersatu membentuk endapan. Menurut Suwanto et al., 1993, keuntungan penggunaan PEG adalah tidak
bersifat toksik, tidak mudah terbakar, dan memiliki efek protektif terhadap protein. Suhartono 1989 juga menyebutkan bahwa enzim-enzim stabil dalam
fase PEG. Sistem dua fase yang terdiri atas dekstran dan PEG sering digunakan untuk pemisahan enzim, protein, dan antibiotik. Paquet et.al.
1993 menggunakan sistem ini untuk memisahkan antibiotik pristinamycins. Polimer lain yang sering digunakan dalam presipitasi asam nukleat
adalah PEI polietilen imin. Menurut Imber dan Bickle 1981, PEI yang digunakan adalah PEI 10 dengan konsentrasi akhir pada supernatan sebesar
1 dan garam yang digunakan adalah NaCl dengan konsentrasi akhir 0.2 M.
Chandrashekaran et al. 1999 menggunakan PEI dengan konsentrasi akhir 1 dan KCl 0.25 M untuk ekstraksi enzim KpnI. PEI juga digunakan untuk
ekstraksi enzim AbeI oleh Vitkute et al. 1998. Konsentrasi akhir PEI adalah 0.2 dengan pH 7.5 dan garam KCl untuk presipitasi asam nukleat.
Perbandingan metode yang digunakan untuk presipitasi asam nukleat dalam isolasi enzim restriksi dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Metode ekstraksi enzim endonuklease restriksi
Nama enzim Presipitasi asam
nukleat Pemekatan
enzim Purifikasi lanjut
Bal I Gelinas
et al., 1977 Streptomisin
sulfat -
1. kromatografi DEAE- Selulosa
2. kromatografi kolom fosfoselulosa 2x
3. kromatografi kolom ω-
aminoheptil sepharosa Bgl
I Imber dan Bickle,
1981 PEI 1 + NaCl
0.2 M NH
4 2
SO
4
70 1. kromatografi kolom
Heparin-Agarosa HA 2. kromatografi kolom
DEAE-Sephacel Svi
I Yun et al., 1995
Streptomisin sulfat
NH
4 2
SO
4
45-80 1. kromatografi kolom
fosfoselulosa P11 2. kromatografi kolom
DEAE-Selulosa 3. kromatografi Sephachryl
S-200 HR Abe
I Vitkute et al., 1998
PEI 0.1 pH 7.5 + KCl 0.1
M NH
4 2
SO
4
35-50 1. kromatografi kolom
DEAE-Selulosa 2. kromatografi kolom
Heparin Agarosa HA- Sepharose
Ekstrak enzim Rhodobacter
sp .MW 5
Juliana, 1996 dekstran 7.1
dan PEG 6000 28.4 2x
- -
Ekstrak enzim Xilanase
negatif A Rusli, 2006
dekstran 7.1 dan PEG 8000
28.4 2x -
- Penelitian ini
dekstran 7.1 dan PEG 6000
28.4 2x -
-
Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan protein dalam sistem dua fase adalah jenis polimer yang digunakan, berat molekul dan ukuran polimer,
konsentrasi polimer, kekuatan ion, pH, dan kemurnian larutan protein. Pada umumnya, polimer dengan berat molekul lebih besar dan konsentrasi yang
lebih rendah dibutuhkan untuk pembentukan sistem dua fase. Hal lain yang dapat dilakukan untuk optimasi pemisahan dengan sistem dua fase
menggunakan PEG dan dekstran adalah menggunakan PEG dengan berat molekul lebih rendah, meningkatkan berat molekul dekstran, meningkatkan
pH jika digunakan fosfat, dan meningkatkan konsentrasi fosfat Andrews dan Asenjo, 1989.
Penelitian ini menggunakan sistem dua fase yang terdiri dari dekstran 7.1 dan PEG 6000 28.4 . Menurut Juliana 1996, komposisi tersebut telah
memberikan hasil yang baik dalam presipitasi asam nukleat. Pengulangan ekstraksi dengan polimer konsentrat sebanyak 2 kali menghasilkan enzim
restriksi dengan aktivitas pemotongan yang baik pada substrat DNA fage lambda. Ekstraksi sebanyak 1 kali menghasilkan enzim restriksi yang tidak
dapat memotong DNA fage lambda. Hal tersebut diakibatkan enzim hasil ekstraksi masih mengandung senyawa pengotor seperti asam nukleat.
Ekstraksi sebanyak 3 kali juga tidak menghasilkan enzim restriksi dengan aktivitas pemotongan yang baik karena enzim mungkin ikut mengendap
bersama polimer konsentrat atau mengalami kerusakan akibat ekstraksi berlebihan.
Chaplin 2004 mengemukakan bahwa sistem pemisahan berdasarkan fase sangat penting dalam aplikasi bioteknologi karena pemisahan protein
dapat dilakukan secara cepat tanpa merusak struktur protein itu sendiri. Sistem ini juga telah berhasil memisahkan tipe yang berbeda dari membran dan
organel sel dan purifikasi enzim. Sel, protein, dan material terdistribusi dalam dua fase berdasarkan koefisien partisinya P, yaitu :
Dimana C
t
menunjukkan konsentrasi fase atas dan C
b
menunjukkan konsentrasi fase bawah. Hasil dan efisiensi pemisahan ditentukan oleh jumlah
relatif material pada dua fase tersebut dan tergantung pada perbandingan volume antar fase. Nilai koefisien partisi lebih besar dari tiga dibutuhkan jika
hasil yield diperoleh dari ekstraksi satu kali. Biasanya koefisien partisi untuk protein berkisar antara 0.01-100. Nilai koefisien partisi dalam sistem dua fase
yang digunakan dalam penelitian ini adalah empat 4. Dengan demikian, komposisi dekstran dan PEG 6000 tersebut cukup sesuai untuk pemisahan
enzim dengan sistem dua fase. Johansson 1998 mengemukakan bahwa penambahan garam merupakan
salah satu cara memberikan kekuatan ionik dalam sistem fase, yang dapat mencegah terjadinya ikatan antara enzim restriksi dengan DNA bakteri. Enzim
dapat diekstraksi dari fase atas PEG jika dilakukan penambahan garam Chaplin, 2004. Garam yang digunakan dalam penelitian ini adalah NaCl
dengan konsentrasi akhir 75 mM. Menurut Juliana 1996, penambahan NaCl sebanyak 75 mM dalam ekstraksi enzim endonuklease restriksi telah
memberikan hasil yang terbaik. Konsentrasi garam yang digunakan harus diperhatikan karena konsentrasi garam sangat berpengaruh terhadap aktivitas
enzim restriksi. Konsentrasi garam yang terlalu tinggi dapat menyebabkan enzim tidak mampu mengikat dan memotong substrat DNA, sedangkan
konsentrasi garam yang terlalu rendah dapat menurunkan aktivitas enzim restriksi.
C. PENGUJIAN AKTIVITAS EKSTRAK ENZIM RESTRIKSI
Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan mereaksikan ekstrak enzim restriksi yang diperoleh dengan substrat berupa plasmid dan DNA fage
lambda dalam kondisi reaksi yang dioptimumkan dengan penambahan buffer reaksi. Penambahan garam dilakukan pada buffer reaksi untuk mengetahui
pengaruh jenis dan konsentrasi garam terhadap aktivitas enzim restriksi. Aktivitas restriksi akan ditunjukkan oleh terpotongnya DNA atau plasmid
menjadi fragmen yang berukuran lebih kecil.
1. Plasmid sebagai Substrat
Kategori