2. Elektroforesis Agarosa
Elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA utas ganda pada pH netral. DNA akan bermuatan negatif pada pH netral
sehingga sampel DNA dalam sumur gel agarosa atau gel akrilamid akan bergerak dari katoda ke anoda bila diberikan aliran listrik. Mobilitas
fragmen DNA dalam elektroforesis tergantung pada ukuran fragmen dan komposisi basa atau sekuens DNA Sealey dan Southern, 1988.
Gel agarosa merupakan salah satu gel elektroforesis yang dapat digunakan dalam pengujian ukuran, keutuhan, homogenitas, dan
kemurnian DNA. Agarosa merupakan polimer linier yang diperoleh dari ekstrak rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan mencampurkan larutan
buffer yang sesuai kemudian dipanaskan hingga menjadi bening. Larutan yang bening dan encer tersebut dituang ke dalam cetakan kemudian
dibiarkan sampai membeku. Agarosa membentuk gel pada kondisi dingin akibat adanya ikatan hidrogen. Ukuran pori yang terbentuk ditentukan oleh
konsentrasi agarosa Boffey, 1986. Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi membuat ukuran pori semakin kecil sehingga kemampuan untuk
memisahkan fragmen DNA berukuran kecil lebih baik Sambrook et al., 1989.
Tabel 4. Konsentrasi agarosa Sambrook et al., 1989
Jumlah agarosa dalam gel wv
Daerah pemisahan yang efisien untuk molekul DNA linier kb
0.3 5-60 0.6 1-20
0.7 0.8-10 0.9 0.5-7
1.2 0.4-6 1.5 0.2-3
2.0 0.1-2
Perlengkapan utama yang dibutuhkan pada proses elektroforesis adalah sumber arus listrik dan sistem buffer reservoir. Sistem buffer dalam
elektroforesis berfungsi mempertahankan pH konstan di dalam reservoir dan gel serta bertindak sebagai elektrolit penghantar arus listrik dalam
medan listrik. Gel biasanya direndam satu milimeter di bawah permukaan
buffer dan DNA dicampur dengan bahan berdensitas tinggi seperti sukrosa, ficoll,atau gliserol sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel.
Bahan pemberat ini dicampur dengan bahan pewarna bromfenol biru dan xylene cyanol
di dalam larutan penghenti reaksi atau blue juice Suwanto, 1993. Penambahan blue juice gel loading buffer bertujuan
meningkatkan densitas sampel dan memberikan warna pada sampel untuk mempermudah pengamatan jalannya elektroforesis Sambrook et
al., 1989.
Kemudian gel direndam dalam larutan etidium bromida untuk perwarnaan. Jika elektroforesis telah selesai, dilakukan destaining.
Destaining berfungsi menghilangkan etidium bromida yang terikat non
spesifik pada bagian gel selain DNA. Gel diamati dengan UV- transilluminator
. Sinar UV yang dipakai terdiri dari dua macam, yaitu gelombang pendek 280 nm dan gelombang panjang 310-320 nm. Gel
biasanya dipotret dengan filter jingga untuk menyaring UV sehingga diperoleh gambar hitam putih yang jelas Suwanto, 1993.
III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN
Isolat bakteri yang digunakan adalah isolat bakteri koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi IPB, yaitu Rhodobacter sp.RshMW4, RshMW5, RshMW7, Rsh
MW9, dan RshMW10, Pseudomonas syringae, Bacillus pumilus Y1, dan beberapa isolat bakteri asal tongkol jagung MBXi K1, MBXi K2, MBXi P1,
Xilanase negatif A. Plasmid diperoleh dengan menggunakan isolat E.coli DH5
α carrier plasmid pUC 19. Media pertumbuhan bakteri yang digunakan adalah media Luria Bertani
LB yang terdiri dari tripton, ekstrak khamir, dan garam NaCl dengan pH 7.0. Penambahan antibiotik ampisilin dilakukan pada pembuatan media
pertumbuhan E.coli pembawa plasmid. Buffer yang digunakan pada tahap sonikasi terdiri dari Tris-HCl 10 mM
pH 7.5, Na
2
EDTA 1 mM, dan β-merkaptoetanol 7 mM. Enzim restriksi
diekstrak dengan akuabides steril, NaCl 2 M, dan polimer konsentrat. Polimer konsentrat terdiri dari polietilen glikol PEG 6000 28.4 ww dan dekstran
T500 7.1 ww. Ekstrak enzim restriksi yang diperoleh diuji aktivitasnya dengan bahan-
bahan seperti buffer reaksi yang dibuat menjadi stok 10 kali, DNA fage lambda komersial dari Fermentas, DNA plasmid hasil isolasi, enzim restriksi
komersial PstI dari Gibco BRL, BamHI dan HindIII dari NEB, dan akuabides steril. Buffer reaksi 10 x terdiri dari Tris-HCl 100 mM pH 7.5, MgCl
2
70 mM, dan
β-merkaptoetanol 70 mM atau Dithiothreitol 10 mM yang dibuat dengan penambahan konsentrasi garam NaCl, KCl, dan CaCl
2
yang bervariasi 50 mM, 100 mM, dan 150 mM dan penambahan BSA.
Bahan-bahan yang digunakan untuk elektroforesis gel agarosa terdiri dari blue juice, gel agarosa, buffer TAE 1x, dan etidium bromida. Komposisi
blue juice dan buffer TAE dapat dilihat pada Lampiran 2.
B. ALAT
Alat-alat yang digunakan adalah sentrifus mikro berpendingin Tommy, eppendorf, tips, pipet mikro, sonikator soniprep-150, shaker, neraca analitik,
pH meter, otoklaf, refrigerator, freezer -20
o
C, vorteks, perangkat elektroforesis, UV-transilluminator, Gene Evaporator, dan alat-alat gelas.
C. METODE PENELITIAN 1.
Penumbuhan Kultur Bakteri
Isolat bakteri yang ada disegarkan kembali dengan cara digoreskan pada media padat Luria Bertani LB Agar kemudian dilihat apakah ada
kontaminasi kultur. Koloni yang tumbuh pada media padat tersebut diambil satu ose dan diinokulasikan pada media LB cair pembuatan sub
kultur. Media yang telah ditumbuhi bakteri tersebut kemudian ditambahkan pada media cair produksi untuk produksi sel bakteri. Media
cair media produksi sel bakteri yang telah diinokulasi tersebut diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1-2 hari.
2. Kultivasi Sel
Kategori