2. Penentuan kondisi optimum pertumbuhan bakteri Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 Penentuan kondisi optimum dilakukan dengan menginokulasi bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 pada media cair inokulum M.Sarley dalam buffer fosfat pH 7 pada suhu ruang yang diinkubasi selama 24 jam.
Kondisi optimum meliputi: variasi suhu ºC 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60, variasi pH 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9, dan variasi waktu inkubasi selama
120 jam dengan interval waktu sampling per 24 jam. Setiap perlakuan ditentukan aktivitas enzim lipase dengan metode Titrimetri.
3. Produksi enzim lipase
Sebanyak 2 inokulum bakteri ditambahkan ke dalam media fermentasi dan
diinkubasi pada suhu optimum, pH optimum dan waktu fermentasi optimum untuk memperoleh jumlah maksimum enzim yang diproduksi.
4. Isolasi enzim Lipase
Isolasi enzim adalah metode pemisahan enzim dari komponen selnya. Pada penelitian ini isolasi enzim dilakukan dengan cara sentrifugasi. Prinsip
sentrifugasi berdasarkan kecepatan sedimentasi dengan cara pemusingan. Sentrifugasi digunakan untuk memisahkan enzim ekstraseluler dari sisa-sisa
sel. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah di bawah suhu kamar untuk menjaga kehilangan aktifitas enzim Suhartono, 1989. Media fermentasi
yang telah diinkubasi, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan putaran 5000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan
ekstrak kasar enzim lipase. Ekstrak kasar enzim lipase kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Titrimetri dan diukur kadar proteinnya dengan
metode Lowry.
5. Uji aktivitas enzim lipase metode Titrimetri Pereira et al., 2001.
a. Uji aktivitas lipase menggunakan larutan NaOH 0,05 N, yaitu, sebanyak 2
mL substrat minyak zaitun, ditambah 1 mL buffer posfat 0,05 M pH 7 dan 1 mL larutan enzim. Campuran larutan substrat dan enzim ini kemudian di
inkubasi pada temperatur 35 ºC selama 30 menit. Kemudian substrat enzim diinaktifkan dengan menggunakan 1 mL campuran aseton : etanol 1:1 ,
lalu tambahkan 5 tetes indikator PP 1 dan titrasi dengan larutan standar NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan pada saat terjadi perubahan warna larutan
menjadi merah muda. Pengukuran aktivitas dilakukan secara duplo. b.
Untuk penentuan blanko dilakukan dengan komposisi larutan yang sama, tetapi saat dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran
aseton : etanol 1:1 sebanyak 1 mL, lalu titrasi dengan prosedur yang sama dengan analisis sampel. Analisis aktivitas lipase dihitung
berdasarkan selisih volume titran sampel dengan blanko, seperti persamaan dibawah ini;
Aktivitas Lipase =
1000 x
x Blanko
V. -
Sampel V.
NaOH V. Enzim x t
Kategori