b. Penentuan pH untuk proses pengikatan enzim lipase pada bentonit
Enzim lipase sebanyak 1 ml diikatkan pada 1 gram bentonit dengan variasi pH 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 dan 8 menggunakan buffer fosfat 0,05 M,
kemudian, diaduk 5-10 menit. Campuran tersebut dibiarkan hingga terpisah antara endapan dan filtrat lalu endapan dan filtrat diuji aktivitas
enzim lipase dengan metode titrimetri.
c. Amobilisasi enzim lipase
Sebanyak 1 mL enzim lipase di amobil dengan 1 gram bentonit pada pH pengikatan. Kemudian campuran diaduk hingga rata dan simpan dalam
fryzer selama 30 menit. Selanjutnya dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali, dicentrifuge dan endapan enzim amobil diuji aktivitasnya untuk
pemakaian berulang dengan metode Titrimetri.
Pemakaian berulang enzim amobil
1. Endapan enzim amobil ditambah 2 mL minyak zaitun dan 1 mL
buffer fosfat 0,05 M pH 7. 2.
Untuk blanko ditambahkan 1 ml campuran aseton : etanol 1:1 3.
Campuran diinkubasi pada suhu 35 ºC selama 30 menit 4.
Kemudian disaring sampai diperoleh filtrat dan endapan 5.
Filtrat di titrasi dengan NaOH 0,05 N menggunakan indikator PP 1 6.
Endapan sebagai enzim lipase amobil yang telah dipakai dilakukan pengulangan sampai enam kali dan setiap pengulangan ditentukan
aktivitas enzim menggunakan metode titrimetri.
9. Karakterisasi enzim lipase sebelum dan sesudah amobilisasi
a. Penentuan suhu optimum
Untuk mengetahui suhu optimum kerja enzim dilakukan dengan memvariasikan suhu yaitu 30, 35; 40; 45; 55; 60; 65; dan 70; .
Selanjutnya aktivitas enzim diukur dengan metode Titrimetri.
b. Penentuan K
M
dan V
maks
Konstanta Michaelis-Menten K
M
dan laju reaksi maksimum V
maks
enzim lipase ditentukan dengan memvariasikan konsentrasi substrat 0.5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5 dalam buffer fosfat pada pH 8 dan suhu 35 ºC
selama 30 menit. Selanjutnya diukur aktivitas enzim dengan metode Titrimetri dan data aktivitas enzim dan konsentrasi substrat diplotkan ke
dalam kurva Lineweaver-Burk untuk penentuan nilai K
M
dan V
maks
.
c. Uji stabilitas termal enzim lipase Yang et al., 1996
Penentuan stabilitas termal enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas sisa enzim setelah diinkubasi selama periode waktu 60 menit pada suhu
dan pH optimum. Caranya adalah dengan mengukur aktivitas enzim setelah proses pemanasan setelah interval waktu 10 menit. Aktivitas awal
enzim tanpa proses pemanasan diberi nilai 100.
Perhitungan aktivitas sisa Virdianingsih, 2002.
d. Penentuan waktu paruh t
12
, konstanta laju inaktivasi k
i
, dan perubahan energi akibat denaturasi ∆G
i
Penentuan nilai k
i
konstanta laju inaktivasi termal enzim lipase hasil pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan
persamaan kinetika inaktivasi orde 1 Kazan et al., 1997 dengan persamaan:
ln E
i
E = - k
i
t Sedangkan untuk perubahan energi
akibat denaturasi ∆G
i
enzim hasil pemurnian dan hasil amobilisasi dilakukan dengan menggunakan
persamaan Yandri et al., 2007: ∆G
i
= - RT ln k
i
hk
B
T Keterangan :
R = konstanta gas 8,315 J K
-1
mol
-1
T = suhu absolut K
k
i
= konstanta laju inaktivasi termal h
= konstanta Planck 6,63 x 10
-34
J det k
B
= konstanta Boltzmann 1,381 x 10
-23
JK
-1
