yang telah diinkubasi, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan putaran 5000 rpm pada suhu 4°C selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh merupakan
ekstrak kasar enzim lipase. Ekstrak kasar enzim lipase kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Titrimetri dan diukur kadar proteinnya dengan
metode Lowry.
5. Uji aktivitas enzim lipase metode Titrimetri Pereira et al., 2001.
a. Uji aktivitas lipase menggunakan larutan NaOH 0,05 N, yaitu, sebanyak 2
mL substrat minyak zaitun, ditambah 1 mL buffer posfat 0,05 M pH 7 dan 1 mL larutan enzim. Campuran larutan substrat dan enzim ini kemudian di
inkubasi pada temperatur 35 ºC selama 30 menit. Kemudian substrat enzim diinaktifkan dengan menggunakan 1 mL campuran aseton : etanol 1:1 ,
lalu tambahkan 5 tetes indikator PP 1 dan titrasi dengan larutan standar NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan pada saat terjadi perubahan warna larutan
menjadi merah muda. Pengukuran aktivitas dilakukan secara duplo. b.
Untuk penentuan blanko dilakukan dengan komposisi larutan yang sama, tetapi saat dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran
aseton : etanol 1:1 sebanyak 1 mL, lalu titrasi dengan prosedur yang sama dengan analisis sampel. Analisis aktivitas lipase dihitung
berdasarkan selisih volume titran sampel dengan blanko, seperti persamaan dibawah ini;
Aktivitas Lipase =
1000 x
x Blanko
V. -
Sampel V.
NaOH V. Enzim x t
Keterangan : V.sampel
: Volume titran sampel mL V.blanko
: Volume titran blanko mL [NaOH]
: Konsentrasi NaOH Normalitas V.enzim
: Volume enzim mL t.
: waktu inkubasi menit 1000
: nilai konversi dari mmol kedalam satuan µmol
6. Penentuan kadar protein metode Lowry Lowry et al., 1951.
Sebanyak 0,1 mL enzim ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi C dan diaduk rata. Kemudian dibiarkan selama 10 menit pada
suhu ruang. Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Untuk
kontrol, 0,1 mL enzim diganti dengan 0,1 mL akuades, selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel. Serapannya diukur menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar BSA Bovine
Serum Albumin.
7. Pemurnian Enzim Lipase
Enzim lipase yang diperoleh dimurnikan melalui 2 tahap sebagai berikut:
a. Fraksinasi dengan amonium sulfat [NH
4 2
SO
4
]
Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan garam ammonium sulfat pada berbagai derajat kejenuhan yaitu 0-20 ; 20-40; 40-
60; 60-80; dan 80-100. Skema proses pengendapan ditunjukkan pada Gambar 8. Sejumlah ekstrak kasar enzim yang diperoleh
ditambahkan garam ammonium sulfat secara perlahan sambil diaduk dengan magnetic stirer pada suhu 4°C. Endapan protein enzim yang
didapatkan pada tiap fraksi kejenuhan ammonium sulfat dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi dingin pada kecepatan 5000 rpm selama 30
menit. Kemudian diuji aktivitasnya dengan metode Titrimetri, serta diukur kadar proteinnya dengan metode Lowry.
Gambar 8. Skema proses pengendapan protein enzim dengan pengendapan ammonium sulfat
+ NH
4 2
SO
4
0-20
+ NH
4 2
SO
4
20-40 Ekstrak Kasar Enzim
EndapanF1 Filtrat
EndapanF2 Filtrat
EndapanF3 Filtrat + NH
4 2
SO
4
40-60
EndapanF4 Filtrat + NH
4 2
SO
4
60-80
+ NH
4 2
SO
4
80-100 EndapanF5 Filtrat
