Pengaruh Konsentrasi Induser Dan Penambahan Kofaktor Enzim Terhadap Produksi Ekstrak Kasar Enzim Lipase Ekstraseluler Oleh Pseudomonas aeruginosa

(1)

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN

KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK

KASAR ENZIM LIPASE EKSTRASELULER

OLEH Pseudomonas aeruginosa

SKRIPSI

JIMMY UTAMI

060802052

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2010

(2)

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN

KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK

KASAR ENZIM LIPASE EKSTRASELULER

OLEH Pseudomonas aeruginosa

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi syarat mencapai gelar sarjana

JIMMY UTAMI

060802052

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

2010

(3)

PERSETUJUAN

Judul

Kategori Nama

Nomor Induk Mahasiswa Pragram Studi

Departemen Fakultas

: : : : : :

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR ENZIM LIPASE EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas aeruginosa SKRIPSI

JIMMY UTAMI 060802052

SARJANA S-1 KIMIA KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

Disetujui di Medan, 01 Januari 2011 Komisi Pembimbing :

Pembimbing 2 Pembimbing 1

Dra. Nunuk Priyani, M.Sc. Dr. Yuniarti Yusak, M.S.

NIP.19640428199603 2 001 NIP. 130 809 726

Diketahui/Disetujui oleh :

Departemen Kimia FMIPA USU Ketua,

Dr. Rumondang Bulan Nst.,M.S. NIP. 195408030198503 2 001

(4)

PERNYATAAN

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR ENZIM LIPASE

EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas aeruginosa

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, 01 Januari 2011

JIMMY UTAMI 060802052

(5)

PENGHARGAAN

Segala puji bagi Allah, Tuhan pemilik alam semesta yang telah begitu banyak melimpahkan rahmat, nikmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR ENZIM LIPASE EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas aeruginosa , yang disusun sebagai salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Sains pada Fakultas MIPA USU.

Ucapan terima kasih terbesar pertama sekali penulis sampaikan kepada kedua orang tua penulis, Ayahanda Suherman. R dan Ibunda Sri Astuti, atas pengorbanan, doa, cinta dan kasih sayangnya yang tak terhingga kepada penulis selama ini. Dan juga kepada Bu Dadek yang sangat banyak membantu penulis, serta kepada seluruh keluarga.

Pada kesempatan ini dengan segala kerendahan hati, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang tulus kepada:

1. _{Ibu Dr. Yuniarti Yusak, M.S. dan Ibu Dra. Nunuk Priyani, M.Sc. selaku} pembimbing I dan II yang dengan kesabarannya telah memberikan arahan, waktu dan perhatiannya kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi ini dari awal hingga akhir.

2. _{Ibu Dr. Rumondang Bulan Nst, MS selaku Ketua Departement Kimia} FMIPA USU.

3. _{Ibu Dra. Emma Zaidar Nst, MSi selaku Kepala Laboratorium Biokimia /} KBM FMIPA USU.

4. _{Bapak Prof. Dr. H. Erman Munir, M. Sc selaku Kepala Laboratorium} Mikrobiologi FMIPA USU.

5. _{Ibu Sovia Lenny, SSi, MSi selaku dosen wali yang dengan kesabarannya} telah memberikan arahan dalam memilih mata kuliah selama menjalani studi

6. _{Teman-teman selama kuliah, teman angkatan 05, 04, 03, adik-adik} stambuk 07, 08, 09, rekan-rekan asisten Lab. Biokimia, rekan-rekan asisten dan teman di Lab. Mikrobiologi.

Akhirnya dengan penuh ketulusan dan kerendahan hati, penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua dari semua pihak demi kesempurnaan skripsi ini, semoga Allah SWT membalas semua kebaikan kita semua dan selalu memberikan jalan yang terbaik. Amin Ya Rabbal Alamin

(6)

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN

KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR

ENZIM LIPASE EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas

aeruginosa

ABSTRAK

Produksi ekstrak kasar enzim lipase ekstraseluler oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa. Dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada variasi konsentrasi induser minyak wijen yang ditambahkan yaitu 2%, 4%, 6%, 8% dan 10% dan dengan pengaruh penambahan koenzim Ca2+ pada masing-masing induser

Parameter yang diamati adalah kadar protein dari ekstrak kasar enzim lipase yang diproduksi dan kadar asam lemak bebas. Kadar protein ditentukan dengan metode pengukuran kuantitatif berdasarkan besar absorbansinya. Uji aktivitas dari ekstrak kasar enzim lipase dilakukan dengan pengukuran kadar asam lemak bebas yang ditentukan dengan metode titrimetri.

Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa produksi ekstrak kasar enzim lipase maksimal terjadi pada penambahan induser dengan konsentrasi 8%, sedangkan dengan adanya kofaktor enzim Ca2+ aktivitas enzim terus meningkat hingga konsentrasi 10%.

(7)

THE EFFECT OF CONCENTRATION INDUCER AND COFACTOR ENZYME ADDITION for CRUDE PRODUCTION OF EXTRACELLULAR

LIPASE ENZYME BY Pseudomonas aeruginosa

ABSTRACT

Crude extract production of extracellular lipase by Pseudomonas aeruginosa was performed by growing the bacteria on various inducer concentration of sesame oil which were 2, 4, 6, 8 and 10% and with combined by addition of coenzyme Ca2+ on each inducer

The parameters measured were protein content of the crude extract produced lipase and free fatty acid concentration. Protein content was analyzed by quantitative measurement method based on the absorbance. The activity of lipase crude extract was determined by measuring the free fatty acid concentration which determined by titrimetric method. It could be concluded that the highest production of crude extract lipase occured on the addition of a inducer with a concentration of 8%, whereas in the presence of cofactor enzyme Ca2+ , enzymeactivity continued to increase until the concentration of 10%.

(8)

DAFTAR ISI

Halaman

Persetujuan ii

Pernyataan iii

Penghargaan iv

Abstrak vi

Abstract vii

Daftar Isi viii

Daftar Tabel xi

Daftar Gambar xii

Daftar Lampiran xiii

Bab 1 Pendahuluan

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Permasalahan 3

1.3 Pembatasan Masalah 3

1.4 Tujuan Penelitian 4

1.5 Manfaat Penelitian 4

1.6 Lokasi penelitian 4

1.7 Metodologi Penelitian 4

Bab 2 Tinjauan Pustaka

2.1 Enzim 6

2.1.1 Kerja Enzim pada Substrat 7

2.1.2 Pengaruh Kadar Enzim dan Substrat 7

2.1.3 Enzim Lipase 8

2.1.4 Hipotesis Operon 9

2.1.4 Ion Logam Sebagai koenzim 11

2.2 Minyak 12

(9)

2.2.2 Analisa Kuantitatif Asam Lemak Bebas 14

2.3 Bakteri 15

2.3.1 Pseudomonas aeruginosa 16

2.4 Media Fermentasi 17

Bab 3 Metodologi Penelitian

3.1 Alat dan Bahan 19

3.1.1 Alat-Alat 19

3.1.2 Bahan-Bahan 20

3.2 Prosedur Penelitian 21

3.2.1 Pembuatan Larutan Pereaksi 21

3.2.2 Sterilisasi Alat 25

3.2.3 Pembuatan Media 26

3.2.4 Sterilisasi Media dan Bahan 26

3.2.5 Pembuatan starter Pseudomonas Aeruginosa 26

3.2.6 Pembuatan Standard Mac Varlan 27

3.2.7 Pembuatan Mac Varlan Bakteri Pseudomonas Aeruginosa 27 3.2.8 Penanaman bakteri pada media cair 27 3.2.9 Penanaman bakteri pada media cair dengan co-enzim Ca2+- 27 3.2.10 Pembuatan ekstrak Kasar Enzim Lipase 28

3.3 Parameter yang Diamati 28

3.3.1 Penentuan Absorbansi Maksimum Larutan Bovine Serum

Albumin 5000µg/mL 28

3.3.2 Penentuan Absorbansi Maksimum Larutan Bovine Serum

Albumin 5000µg/mL 28

3.3.3 Penentuan Kadar Protein Ekstrak Kasar Enzim Lipase

Ekstraseluler Pseudomonas Aeruginosa 28 3.3.4 Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas 29

3.4 Skema Penelitian 30

3.4.1 Skema Pembuatan Media 30

3.4.2 Skema Pembuatan Starter Pseudomonas Aeruginosa 32 3.4.3 Skema Penanaman Media untuk menghasilkan

(10)

3.4.4 Skema Parameter yang diamati 35

Bab 4 Hasil dan Pembahasan

4.1 Hasil penelitian 38

4.1.1. Penentuan panjang gelombang maksimum larutan BSA 38

4.1.2. Penentuan kurva standar larutan BSA pada λ 775 nm 40

4.1.3 Penentuan kadar protein enzim lipase dari

Pseudomonas aeruginosa 40

4.1.4 Penentuan kadar protein enzim lipase

dengan penambahan Ca2+ Pseudomonas aeruginosa 41

4.1.5. Uji aktivitas 42

4.2 Pembahasan Hasil Penelitian 44

Bab 5 Kesimpulan dan Saran

5.1 Kesimpulan 50

5.2 Saran 50

Daftar Pustaka 51

(11)

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 2.1

Tabel 2.2 Tabel 2.3 Tabel 4.1 Tabel 4.2

Tabel 4.3

Tabel 4.4 Tabel 4.5

Komposisi Asam Lemak Minyak Wijen Komposisi Gizi Wijen / 100 gr

Unsur yang ada pada mikrobia

Absorbansi larutan BSA pada λ 775 nm

Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 %.

Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 % dengan penambahan kofaktor enzim.

Aktivitas ekstrak kasar Enzim Lipase

Aktivits ekstrak kasar Enzim Lipase yang menggunakan kofaktor enzim Ca2+

13 14 17 40

42 43 43

(12)

DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 2.3 Gambar 2.4 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.2.2 Gambar 4.2.3 Gambar 4.2.4 Gambar a Gambar b Gambar c Gambar d

Grafik hubungan konsentrasi enzim dan kecepatan reaksi.

Stereokimianya interaksi ikatan enzim dengan substrat Struktur Lipid.

Mekanisme Lac_Operon

Grafik Penentuan panjang gelombang maksimum larutan BSA 5000 µg/mL.

Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 %.

Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 % dengan penambahan kofaktor enzim.

Kadar Asam Lemak Bebas (%) Pada Ekstrak kasar Enzim Lipase.

Kadar Asam Lemak Bebas (%) Pada Ekstrak Kasar Enzim Lipase dengan Penambahan kofaktor enzim Ca2+ .

Pure culture Pseudomonas aeruginosa. starter Pseudomonas aeruginosa siap pakai.

Hasil biakan Pseudomonas aeruginos pada media cair. Hasil biakan Pseudomonas aeruginos pada media cair

dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+.

8 8 9 10 38 44 45 47 47 59 62 62 63

(13)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1

Lampiran 2

Lampiran 3

Lampiran 4

Lampiran 5

Lampiran 6

Penentuan kurva standar pada λ 775 nm.

Absorbansi ekstrak kasar enzim lipase pada konsentrasi minyak wijen 2, 4, 6, 8, 10 %.

Absorbansi ekstrak kasar enzim lipase dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+ pada konsentrasi minyak wijen 2, 4, 6, 8, 10 %.

Penentuan kadar Asam Lemak Bebas pada ekstrak kasar enzim lipase pada minyak wijen.

Penentuan kadar Asam Lemak Bebas pada ekstrak kasar enzim lipase dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+ pada minyak wijen.

Gambar penelitian

61 62

(14)

PENGARUH KONSENTRASI INDUSER DAN PENAMBAHAN

KOFAKTOR ENZIM TERHADAP PRODUKSI EKSTRAK KASAR

ENZIM LIPASE EKSTRASELULER OLEH Pseudomonas

aeruginosa

ABSTRAK

(15)

THE EFFECT OF CONCENTRATION INDUCER AND COFACTOR ENZYME ADDITION for CRUDE PRODUCTION OF EXTRACELLULAR

LIPASE ENZYME BY Pseudomonas aeruginosa

ABSTRACT

(16)

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Proses hidrolisis minyak/lemak menjadi asam lemak dan gliserol secara komersial yang sampai kini digunakan, beroperasi pada suhu 240-250oC dan tekanan 45-50 bar. Kondisi proses ini membawa konsekuensi kebutuhan biaya investasi yang tinggi, karena peralatan proses utama pabrik harus tahan terhadap suhu dan tekanan yang tinggi, serta tahan terhadap asam (korosif). Proses ini juga mengkonsumsi energi yang besar untuk mempertahankan kondisi operasinya. Oleh karenanya perlu dicari alternatif proses yang dapat berlangsung pada suhu dan tekanan rendah. Proses hidrolisis enzimatik menggunakan enzim lipase memenuhi kriteria tersebut. (Malcolm, D, 1964)

Penelitian-penelitian produksi enzim lipase terdahulu yang pernah dilakukan pada umumnya menggunakan limbah minyak kelapa sawit sebagai induser untuk memacu produksinya (Priyani, Nunuk, 2001). Pada penelitian ini digunakan minyak wijen sebagai indusernya, karena Wijen (Sesamum indicum L.) merupakan komoditas pertanian yang sangat potensial sebagai penghasil minyak nabati yang dibutuhkan dalam industri kosmetik, farmasi, makanan, dan lain-lain. Wijen mendapat julukan The Queen of Oil Seeds Crops, yang mencerminkan bahwa biji wijen memiliki kandungan gizi yang tinggi dan berdampak positif bagi konsumennya (Handajani, 2006).

Enzim adalah protein yang diproduksi dari sel hidup dan digunakan oleh sel-sel untuk mengkatalisis reaksi kimia yang spesifik. (Shahib, 1992). Enzim dikatakan sebagai suatu kelompok protein yang berperan sangat penting dalam aktivitas

(17)

biologis. Dalam jumlah yang sangat kecil, enzim dapat mengatur reaksi tertentu dan mempunyai sifat sangat spesifik, karena hanya bekerja pada induser tertentu (Girindra, 1990) yang dalam aktivitasnya enzim kadang-kadang membutuhkan kofaktor yang bisa berupa senyawa organik atau logam (Soeharsono, 1989).

Enzim lipase atau lengkapnya triasilgliserol lipase adalah enzim yang menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai induser alami berupa trigliserida dan lipase ekstraseluler berhasil diisolasi dari Pseudomonas aeruginosa pada tahun 1986. Enzim lipase stabil pada suhu optimumnya yaitu 30o , walaupun masih aktif pada 51o C. (Nishio, 1987)

Pseudomonas aeruginosa merupakan salah satu spesies dari genus Pseudomonas. Bakteri ini dapat menggunakan lebih dari 80 macam bahan organik untuk pertumbuhannya, tetapi Pseudomonas dapat menggunakan arginine dan nitrat sebagai elektron akseptor sehingga dapat tumbuh pada suasana anaerob. Pseudomonas aeruginosa tumbuh pada suhu 35-42oC.

Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa Pseudomonas sp merupakan salah satu anggota bakteri gram negatife yang umumnya menggunakan protein atau lipid sebagai sumber energi maupun sumber carbon dan juga mampu menguraikan berbagai jenis induser (Mc Clay, 1996 dan Wischnak, 1998), sedangkan minyak dan lemak tergolong kepada anggota dari golongan lipid yaitu lipid netral. Minyak dan lemak yang telah dipisahkan dari jaringan asalnya mengandung sejumlah komponen selain trigliserida, yaitu: 1. Lipid kompleks (yaitu leshitin, cephalin, fosfatida, lainnya serta glikolipid), 2. Sterol, berada dalam keadaan bebas atau terikat dengan asam lemak, 3. Asam lemak bebas, 4. Lilin, 5. Pigmen yang larut dalam lemak, dan 6. Hidrokarbon. (Ketaren, 1986)

Minyak wijen mengandung kurang lebih 0,3-0,5 % sesameoil, fenol berikatan 1-4 yang dikenal sebagai sesamol, dan sesamine sekitar 0,5-0,1 %.. Minyak wijen juga mengandung asam-asam lemak, seperti: Palmitat 9,1%, stearat 4,3%, arachidat 0,8%, oleat 45,4%, dan linoleat 40,4% ( Hilditch, 1947). Dimana menurut penelitian Abigor dkk (2002). Wijen digunakan sebagai katalis enzim lipase dan dapat bekerja dengan

(18)

baik dan tetap aktif pada pH 7-7,5. Bakteri pada umumnya akan tumbuh dan berkembang dengan cepat, membentuk suatu koloni bila ditanam pada media pembenihan yang sesuai. (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003), dan dengan penambahkan ion magnesium kedalam media pertumbuhan dapat menstimulasi pelepasan lipase ektraseluler dari dinding sel mikroorganisme sehingga dapat meningkatkan pembentukan lipase (Aisaka & Terada, 1979), dimana kofaktor dari ion logam Ca2+ dalam konsentrasi yang rendah akan mengaktifkan reaksi enzimatik lipase (Malcolm, D, 1964).

1.2 Permasalahan

Berdasarkan penelitian terdahulu dimana kofaktor dapat memantapkan kerja enzim (Malcolm, D, 1964) maka kami ingin meneliti bagaimana pengaruh konsentrasi minyak wijen yang digunakan sebagai induser dan penambahan kofaktor enzim Ca2+ terhadap produksi enzim lipase oleh Pseudomonas aeruginosa.

1.3 Pembatasan Masalah

Dalam penelitian ini hanya terbatas pada objek masalah yang berhubungan dengan penelitian ini saja yaitu :

1. Enzim yang digunakan diperoleh dari bakteri Pseudomonas aeruginosa yang diperoleh dari Laboratotium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA USU. 2. Bakteri Pseudomonas aeruginosa yang digunakan adalah yang ber- tipe TJB

01 (Warsito, K. 2009).

3. Induser yang digunakan adalah minyak wijen dengan variasi konsentrasi 2%, 4%, 6%, 8%, dan 10%.

4. Kofaktor enzim yang digunakan adalah Ca2+ (Malcolm, D, 1964) yang berasal dari Kristal CaCl2

5. Buffer yang digunakan adalah buffer fosfat (Rita, R, et all, 1989) dengan pH 7,0 (Abigor dkk 2002).

6. Waktu inkubasi dalam memproduksi enzim lipase adalah 3x24 jam dengan kecepatan shaker adalah 150 rpm.

(19)

7. Parameter yang diamati adalah besar absorbansi dari ekstrak kasar enzim lipase yang diproduksi dan kadar asam lemak bebas.

8. Untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim lipase dilakukan dengan Sentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm.

9. Penentuan kadar enzim lipase kasar yang dilakukan dengan metode pengukuran kuantitatif menggunakan Spektrofotometri UV-Visible dan Spektrometri Genecese 20.

10.Penentuan kadar asam lemak bebas dilakukan dengan metode titrasi (Ketaren, 1986).

1.4 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Untuk mengetahui pengaruh perbedaan konsentrasi induser yang ditambahkan ke dalam media terhadap hasil produksi enzim lipase ekstraseluler oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa.

2. Untuk mengetahui pengaruh penambahan kofaktor enzim terhadap jumlah produksi enzim lipase ekstraseluler yang dihasilkan.

1.5 Manfaat Penelitian

Dari hasil penelitian diharapkan:

1. Dapat diketahui kondisi optimum dari bakteri Pseudomonas aeruginosa sehingga dapat memproduksi enzim lipase ekstraseluler secara maksimal. 2. Dapat mengetahui pengaruh penambahan kofaktor enzim terhadap enzim

lipase ektraseluler yang diproduksi oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa TJB01.

1.6 Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia FMIPA-USU, Medan, Laboratorium Mikrobiologi FMIPA-USU, Medan, dan Laboratorium Proteksi Bahan Pangan Dinas Pertanian Sumatera Utara, Medan.

(20)

1.7 Metodologi Penelitian

Penelitian ini adalah eksperimental laboratorium, dengan menggunakan biakan murni Bakteri Pseudomonas aeruginosa yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU dan sampel yang digunakan sebagai induser berupa minyak wijen yang diperoleh dari Supermarket VIGO Medan. Pada penelitian ini untuk mendapatkan kondisi yang optimum, maka Pseudomonas aeruginosa ditumbuhkan pada media dengan sumber carbon yang berasal dari minyak wijen dengan konsentrasi yang divariasikan, sebagai sumber nitrogen yang diujikan adalah 0,3% ammonium nitrat (NH4NO3) (Chen SY et.al, 2007) dan komposisi senyawa lain yang juga dibuat tetap

yaitu: KH2PO4 dan K2HPO4 (ATCC, 1989) sebagai buffer pada pH 7 (Abigor dkk

(2002) 0,02% MgSO4.7H2O (Koch, et al, 1991) penambahan Co-enzim Ca2+

(Malcolm, D, 1964) yang berasal dari 1,5% CaCL2.2H2O (Gupta, V.K, 2008), dimana

langkah-langkahnya adalah sebagai berikut :

Dalam penelitian ini digunakan tiga variabel yaitu variabel tetap, variabel bebas dan variabel terikat.

1. Variabel tetap meliputi : Jenis induser, jenis kofaktor enzim, jumlah bakteri yang dimasukkan, temperatur, pH, tempat produksi, dan lama produksi.

2. Variabel bebas meliputi : Konsentrasi induser, komposisi media.

3. Variabel terikat meliputi : Produksi enzim lipase yang diukur berdasarkan nilai absorbansi sampel (Abs),dan kadar asam lemak bebas (%).

(21)

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1Enzim

Enzim adalah protein yang diproduksi dari sel hidup dan digunakan oleh sel-sel untuk mengkatalisis reaksi kimia yang spesifik. Enzim memiliki tenaga katalitik yang luar biasa dan biasanya lebih besar dari katalisator sintetik. Spesifitas enzim sangat tinggi terhadap substratnya. Tanpa pembentukan produk samping enzim merupakan unit fungsional untuk metabolisme dalam sel, bekerja menurut urutan yang teratur. Sistem enzim terkoordinasi dengan baik menghasilkan suatu hubungan yang harmonis diantara sejumlah aktivitas metabolic yang berbeda (Shahib, 1992). Enzim dikatakan sebagai suatu kelompok protein yang berperan sangat penting dalam aktivitas biologis. Dalam jumlah yang sangat kecil, enzim dapat mengatur reaksi tertentu sehingga dalam keadaan normal tidak terjadi penyimpangan-penyimpangan hasil akhir reaksinya. Enzim ini akan kehilangan aktivitasnya akibat panas, asam atau basa kuat, pelarut organik, atau pengaruh lain yang bisa menyebabkan denaturasi protein. Enzim dikatakan mempunyai sifat sangat khas, karena hanya bekerja pada substratnya (Girindra, 1990).

Untuk aktivitasnya kadang-kadang enzim membutuhkan kofaktor yang bisa berupa senyawa organik atau logam. Senyawa organik itu terikat pada bagian protein enzim. Bila ikatan itu lemah maka kofaktor tadi disebut co-enzim dan dan jika terikat erat melalui ikatan kovalen maka dinamakan gugus prostetis. Pada umumnya dua kofaktor itu tidak dibedakan dan disebut co-enzim saja. Apabila enzim itu terdiri dari bagian seperti yang diterangkan diatas maka keseluruhan enzim itu dinamakan holo enzim. Bagian protein dinamakan apo-enzim dan bagian non proteinnya disebut co-enzim.fungsi logam pada umumnya adalah untuk memantapkan ikatan substrat pada

(22)

enzim atau mentransfer electron yang timbul selama proses katalisis (Soeharsono, 1989).

2.1.1 Kerja Enzim Pada Substrat

Enzim meningkatkan kemungkinan molekul-molekul yang bereaksi saling bertemu dengan permukaan yang saling berorientasi. Hal ini terjadi karena enzim mempunyai suatu afinitas yang tinggi terhadap substrat dan mempunyai kemampuan untuk mengikat substrat tersebut walaupun bersifat sementara. Penyatuan antara substrat dengan enzim sangat spesifik substrat terikat dengan enzim sedemikian rupa, sehingga setiap substrat terorientasi secara tepat untuk terjadi reaksi.

Pembentukan ikatan yang sementara (biasanya ikatan nonkovalen) antara substrat dengan enzim menimbulkan penyebaran elektron dalam molekul substrat dan penyebaran ini menyebabkan suatu regangan pada ikatan kovalen spesifik dalam molekul substrat, sehingga ikatan kovalen tersebut menjadi mudah terpecah. Para ahli biokimia menamakan keadaan dimana terjadi regangan ikatan molekul substrat setelah berinteraksi dengan enzim disebut pengaktifan substrat (Shahib, 1992).

2.1.2 Pengaruh Kadar Enzim dan Substrat

Kecepatan reaksi bergantung pada konsentrasi enzim yang berperan sebagai katalisator dalam reaksi itu. Pada gambar 2.1.2 terlihat hubungan jika konsentrasi enzim yang digunakan tetap, sedangkan substrat dinaikkan. Di sini dapat terlihat bahwa pada penambahan pertama kecepatan reaksi naik dengan cepat. Tetapi jika penambahan substrat dilanjutkan, dilanjutkan maka tambahan kecepatan mulai menurun sampai pada suatu ketika tidak ada tambahan kecepatan reaksi lagi (Girindra, 1990).

(23)

Gambar. 2.1

Pada Substrat yang spesifik, enzim akan mengkatalisis reaksi sehingga menghasilkan produk yang spesifik, juga pada penambahan pereaksi kimia tertentu dapat mengakibatkan enzim menunjukkan bentuk stereokimianya dimana interaksi enzim dengan substrat terjadi dalam ikatan, dimana kelebihan substrat tidak dapat diikat seluruhnya oleh enzim (Trevar, 1985).

2.1.3 Enzim lipase

Lipase yang berasal dari bakteri pada umumnya adalah protein yang memiliki sifat asam. Dan mempunyai berat molekul dari 20.000 sampai 60.000. Memiliki aktivitas

Kinetika Orde pertama (Fase I)

Gabungan “Orde 0” dan “orde 1”

Orde 0 (Fase II)

Kecepatan maksimum (v)

Konsentrasi substrat

v/2

Substrat

R’ R’

R’

A- A-

A-

Gambar 2.2

Enzim

(24)

spesifik protein murni yang berubah-ubah dari 500 sampai 10.000 unit lipase per mg protein (Fogarty, William, M. 1983).

Gambar 2.3. Lipid (Triasilgliserol)

Enzim lipase atau lengkapnya triasilgliserol lipase adalah enzim yang menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai substrat alami berupa trigliserida dari asam lemak yang mana reaksinya memerlukan air, dan lipase ekstraseluler berhasil diisolasi dari Pseudomonas aeruginosa pada tahun 1986. Enzim lipase memiliki sub unit berupa glikoprotein dan lipoprotein. Sub unit tersebut dapat sebagai monomer, dimer, oligomer atau polimer. Enzim lipase stabil pada suhu optimumnya yaitu 30o C, walaupun masih aktif pada 51o C, (Nishio, 1987). Dan menurut penelitian Abigor dkk (2002) wijen digunakan sebagai katalis enzim lipase dan dapat bekerja dengan baik dan bertahan hidup pada pH 7-7,5.

Pada banyak mikroorganisme, bagian yang kuat dari lipase ekstraseluler sebagian masih terikat pada dinding sel. Karena adanya ikatan antara enzim dan dinding sel mungkin menghambat ekskresi lipase berikutnya dalam media pertumbuhan dan dengan demikian menurunkan hasil lipase ekstraseluler. Zat yang dapat menstimulai pelepasan lipase dari dinding sel sehingga dapat meningkatkan pembentukan lipase yaitu dengan menambahkan ion magnesium kedalam media pertumbuhan ( Aisaka & Terada, 1979).

2.1.4 Hipotesis Operon

Dari aktivitas β-galaktosidase dalam sel E. Coli diusulkan hipotesis operon untuk kontrol genetik dari sintesis protein pada prokariota. Jenis peraturan sintesis protein yang diberikan oleh konsep operon membicarakan tentang kontrol transkripsi, karena

(25)

kontrol yang diberikan terutama pada transkripsi gen menjadi mRNAs yang sesuai. Ada cara umum lain dalam sintesis protein, yaitu, dengan kontrol translasi laju sintesis dari rantai polipeptida dari template mRNA-nya. Kontrol transkripsi tampaknya menjadi mekanisme utama untuk pengaturan ekspresi gen pada bakteri. Kontrol Translational, yang tidak dipahami dengan baik, tampaknya merupakan mekanisme sekunder pada bakteri tetapi sangat penting dalam eukariota.

Dari eksperimen mereka Jacob dan Monod terdapat tiga gen struktural z, y, dan a coding untuk mensintesis β-galaktosidase, permease dan protein A, masing-masing, yang semuanya dapat diinduksi oleh laktosa, terletak berdekatan satu sama lain dalam kromosom E. coli dan DNA mengisi letak lain di dekat gen ini. Bagian i ini diusulkan menjadi gen regulasi coding untuk sekuens asam amino dari protein yang disebut represor, ketika gen i ditranskripsi untuk membentuk mRNA yang sesuai, yang berdifusi terakhir ke ribosom dan ada bertindak sebagai template untuk sintesis represor. Protein represor mengikat bagian lain pada segmen tertentu pada DNA yang disebut operator. Pengikatan protein represor ke situs operator dalam DNA dipostulatkan untuk mencegah atau menekan transkripsi oleh RNA polimerase dari tiga gen struktural z, y, dan a coding untuk tiga enzim diinduksi oleh 3-galactosides,

Gambar 2.4 Mekanisme Lac_Operon

Untuk menjelaskan tindakan dari inducer, ketika glukosa tidak tersedia, tetapi laktosa ada, Jacob dan Monod mengajukan bahwa ia menggabungkan dengan letak

(26)

pengikatan spesifik yang kedua pada protein represor, letak inducer, untuk membentuk sebuah kompleks penginduksi-represor. Ikatan dari inducer disebabkan represor yang akan dibentuk dari operator pada DNA dengan penurunan afinitas untuk yang kedua. Setelah kompleks represor-inducer dilepaskan, gen struktural untuk β -galactosiclase dan dua lainnya protein menjadi tersedia untuk transkripsi oleh RNA polimerase untuk menghasilkan mRNA yang sesuai. Ketiga protein kemudian disintesis dari template mRNA pada ribosom, memungkinkan sel untuk menggunakan laktosa sebagai sumber karbon dan energi.sel-sel yang diambil dari media terakhir, dicuci, dan ditempatkan dalam sebuah medium, sedangkan-laktosa, D-glukosa, yang sel selalu dapat digunakan. Karena konsentrasi laktosa dalam sel sekarang akan menjadi rendah. induser terikat pada protein represor akan terpisahkan jauh, menyebabkan molekul represor untuk kembali ke bentuk aktif, sehingga sekarang terikat dengan afinitas yang tinggi ke bagian operator. Akibatnya, gen-gen struktural untuk β-galaktosidase dan dua protein lain tidak bisa lagi ditranskripsikan, dan karena kekurangan mRNA, protein ini tidak bisa lagi dibuat. Oleh karena itu protein represor, melalui kapasitasnya untuk mengikat baik induser atau operator reversibel tapi tidak keduanya secara bersamaan, sehingga dapat dihitung induksi dan represi keduanya pada sintesis galaktosidase.

Ketiga gen struktural z, - v, dan, a bersama-sama dengan operator o mereka, yang ditunjuk oleh Jacoob dan Monoc sebagai operon, khususnya, Lac_Operon. Sebuah operon tetap terdiri dari kelompok gen struktural fungsional terkait, yang dapat diaktifkan atau dinonaktifkan secara terkoordinasi, bersama dengan operator mereka.(Lehninger, 1982)

2.1.5 Ion Logam sebagai kofaktor-enzim

Ion logam dapat digunakan sebagai aktivasi enzim dan pembawa elektron dengan mekanisme variasi yang berbeda dan lingkungan mikro yang berbeda dalam jenis protein yang berbeda. Fungsi dari ion logam tersebut pada semua enzim, mencakup:

(27)

a) secara tepat menjadi katalis pada enzim, b) Berpartisipasi dalam ikatan substrat pada sisi aktif, c) menjaga konformasi enzim agar tetap sebagai katalis, dan d) berpartisipasi dalam reaksi redoks. Beberapa logam seperti Fe2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+,

Co2+, Mo2+ berikatan sangat kuat dengan enzim dan membentuk metaloenzim, sedangkan logam Mg2+, Ca2+, Mn2+ berikatan lemah dengan enzim sehingga membentuk metal-aktif enzim (Milton, S. H. 1987).

Fakta lain tentang enzim lipase adalah adanya ion logam Ca2+ dalam konsentrasi yang rendah akan mengaktifkan reaksi enzimatik lipase. Senyawa lain yang diketahui memiliki fungsi yang sama dengan Ca2+ adalah EDTA. Tetapi kation divalent lainnya seperti Mg2+, Zn2+, Cu2+, dan Cd2+ pada konsentrasi rendah menghambat aktivitas enzim ini sampai 70%. Dilain pihak Kalium asetat mempertinggi aktivitas enzimatik lipase hingga 4 sampai 5 kali dikisaran konsentrasi 1yang lebih tinggi. Natrium Asetat mendorong kenaikan aktivitas enzimatik sampai dua kali lipat pada konsentrasi rendah dan tidak berpengaruh apa-apa walau dalam konsentrasi tinggi pada pH 7,0-75. Natrium Klorida hanya sampai batas konsentrasi rendah yang mempengaruhi aktivitas enzimatik lipase dan pengaruhnya berupa adanya kenaikan aktivitas enzimatik yang tipis (Schwimmer, S. 1981). Kofaktor akan terikat pada gugus aktif pada molekul protein enzim, sehingga kerja enzim yang ditunjukkan oleh aktivitas meningkat.(Lehninger, 1982)

2.2Minyak

Minyak dan lemak tergolong kepada anggota dari golongan lipid yaitu lipid netral. Lipid itu sendiri dapat diklasifikasikan menjadi 4 kelas yaitu: 1) Lipid netral, 2) Fosfatida, 3) Spingolipid dan 4) Glikolipid.

Minyak dan lemak yang telah dipisahkan dari jaringan asalnya mengandung sejumlah komponen selain trigliserida, yaitu: 1) Lipid kompleks (yaitu leshitin, cephalin, fosfatida, lainnya serta glikolipid), 2) Sterol, berada dalam keadaan bebas atau terikat dengan asam lemak, 3) Asam lemak bebas, 4) Lilin, 5) Pigmen yang larut dalam lemak, dan 6) Hidrokarbon (Ketaren, 1986).

(28)

Rata-rata komposisi minyak terdiri dari 58,2% sebagai sampel jenuh, 28,6% senyawa aromatik dan 14,2% senyawa polar. Berdasarkan klasifikasi minyak, senyawa aromatik ini adalah senyawa hidrokarbon yang terdiri dari cincin yang mengandung enam atom karbon. Hampir kebanyakan senyawa aromatik ini bermassa rendah dan jumlahnya dalam minyak sekitar 10-30% (Syakti, 2005).

2.2.1 Minyak Wijen

Tanaman wijen (Sesamum indicum L) termasuk family Pedaliaceae, varietas Sesamum indicum sub spesies ialah S. orientale. (Ketaren, 1986) Minyak wijen mengandung zat tidak tersabunkan dalam jumlah relative tinggi. Tetapi kandungan tertinggi adalah sterol dan zat-zat yang tidak dapat dipisahkan dengan pemurnian, sedangkan kadar bahan non minyak lainnya relative rendah (Bailey, 1951).

Minyak wijen mengandung kurang lebih 0,3-0,5 % sesameoline, fenol berikatan 1-4 yang dikenal sebagai sesamol, dan sesamine sekitar 0,5-0,1 %.. Minyak wijen juga mengandung asam-asam lemak, yaitu:

Asam Lemak Rumus Persen

Asam lemak jenuh Palmitat Stearat Arachidat

Asam lemak tidak jenuh Oleat

Linoleat linolenat

C16H32O2

C18H36O2

C20H40O2

C18H34O2

C18H32O2

C18H30O2

9,1 4,3 0,8

45,4 40,4

( Hilditch, 1947)

(29)

Komposisi Jumlah (gr) Air

Protein Lemak Karbohidrat Ca

P Fe

Vitamin B1 Vitamin C

Bagian yang dapat dimakan

6 19,3 57,1 18,1 0,0012 0,614 0,0095 0,00093 0,0058 100 (Ketaren, 1986)

Tabel 2.2. Komposisi Gizi Wijen / 100 gr

2.2.2 Analisis Kuantitatif Asam Lemak Bebas

Kadar Asam lemak bebas dinyatakan sebagai jumlah rata-rata dari bobot asam lemak yang tidak lagi terikat dengan molekul trigliserida dari setiap gram minyak atau lemak. Soumano telah meneliti terbentuknya asam lemak yang bebas tersebut pada saat reaksi interesterifikasi enzimatik minyak nabati dengan biokatalis berbagai jenis lipase (Soumanou, M.M. 1997).

Untuk menentukan kadar minyak atau lemak dapat digunakan bilangan penyabunan yaitu jumlah milligram KOH yang diperlukan untuk menyabunkan satu gram minyak atau lemak. Dalam penetapan bilangan penyabunan biasanya larutan alkali yang dipergunakan adalah KOH, yang diukur dengan hati-hati dengan menggunakan buret dan pipet.

Campuran minyak atau lemak dengan larutan KOH didihkan pada pendingin alir balik sampai terjadi penyabunan yang lengkap, kemudian larutan KOH yang tersisa ditetapkan dengan jalan titrasi dengan larutan HCl 0,5 N. Bilangan penyabunan dapat ditetapkan dengan jalan mengurangkan jumlah miliequivalen larutan alkali beralkohol yang dipergunakan, dikalikan dengan berat molekul dari larutan alkali

(30)

tersebut, dibagikan dengan berat contoh dalam gram. Berat molekul untuk larutan KOH adalah 56,1 : sedangkan berat molekul larutan NaOH adalah 39,9.

contoh gram

HCl N x HCl ml KOH N x KOH ml Penyabunan

Bilangan = 56,1( )( )

(Ketaren, 1986).

Cara lain untuk menentukan kadar asam lemak bebas dalam minyak nabati yaitu dengan memodifikasi perhitungan menjadi bilangan asam atau acid value (AV). Bilangan asam dinyatakan sebagai mg KOH yang dibutuhkan untuk mentitrasi asam lemak bebas yang terkandung dalam 1 g minyak. Karenanya, pada perhitungan bilangan asam, harus diketahui berat minyak yang bersangkutan (AOCS, 1989).

Terdapat sejumlah metode penentuan kadar asam lemak bebas selain metode titri metri yaitu seperti metode yang didasarkan pada pengukuran PH atau tingkat keasaman, dan teknik-teknik spektoskopi dengan atau tanpa pelarut (Velasco Arjona, A. et al, 1998).

2.3 Bakteri

Bakteri adalah mikroorganisme bersel satu dan berkembang biak dengan membelah diri. Ukuran bakteri bervariasi baik penampang maupun panjangnya, tetapi pada umumnya penampang bakteri adalah sekitar 0,7-1,5 µm dan panjangnya sekitar 1-6µ m. Bentuk bakteri dibagi menjadi 3 yaitu :

1. Sferis (kokus)

Bakteri ada yang berbentuk sferis atau bulat, seperti ada yang ditemukan pada genus Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria dan lain-lain

2. Batang (basil)

Bakteri yang berbentuk batang lurus misalnya dapat dijumpai pada famili Enterobacteriaceae seperti Escheria coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae maupun famili Bacillaceae seperti genus Clostridium dan genus

(31)

Bacillus yaitu Bacillus anthracis penyebab penyakit anthraks. Selain bentuk batang lurus, dijumpai pula bentuk batang bengkok misalnya pada bakteri Vibrio cholera penyebab penyakit cholera.

3. Spiral

Bakteri berbentuk spiral dijumpai pada penyebab penyakit sifilis yaitu Treponema pallidum, bakteri penyebab demam bolak-balik yaitu Borelia reccurentis (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003).

2.3.1 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa merupakan salah satu spesies dari genus Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa bergerak aktif dengan flagella polar dan mempunyai ukuran lebar 0,5-1 µm dan panjang 3-4 µ m dan bersifat aerob. Bakteri ini dapat menggunakan lebih dari 80 macam bahan organik untuk pertumbuhannya, tetapi Pseudomonas dapat menggunakan arginine dan nitrat sebagai elektro akseptor sehingga dapat tumbuh pada suasana anaerob. Pseudomonas aeruginosa tumbuh pada suhu 35-42oC. P.aeruginosa menghasilkan pigmen piosianin (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003).

Menurut Donnel, 1994 klasifikasi bakteri Pseudomonas adalah sebagai berikut:

Kingdom : Prokaryotae Divisio : Gracilitutes Kelas : Protobakteria Famili : Pseumonadacae Genus : Pseudomonas Spesies : Pseudomonas sp.

Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa Pseudomonas sp merupakan salah satu anggota bakteri gram negative yang umumnya menggunakan protein atau lipid sebagai sumber energi maupun sumber carbon dan juga mampu menguraikan berbagai jenis substrat (Mc Clay, 1996 dan Wischnak, 1998).

(32)

2.4Media Fermentasi

Untuk mendapatkan biakan murni bakteri, bahan pemeriksaan klinis tersebut ditanam pada media pembenihan. Media pembenihan yang digunakan untuk isolasi primer tergantung dari dugaan kemungkinan bakterinya, namun biasanya digunakan media pembenihan padat yang mengandung agar-agar untuk mendapatkan koloni bakteri yang terpisah (isolated colony). Bakteri pada umumnya akan tumbuh dan berkembang dengan cepat, membentuk suatu koloni bila ditanam pada media pembenihan yang sesuai setelah diinkubasikan selama 18-24 jam pada suhu yang sesuai pula. (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003).

Medium kultur harus mengandung semua elemen yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikrobia, dalam proporsi yang serupa dengan yang ada pada sel mikrobia yaitu :

Unsur Fungsi Fisiologi Berat kering

(%) Hidrogen Oksigen Karbon Nitrogen Sulfur Fosfor Magnesium Mangan Kalsium Besi Kobalt Tembaga, seng Molybdenum

Penyusun senyawa organik Penyusun senyawa organik Penyusun senyawa organik

Penyusun protein, asam nukleat, dan koenzim Penyusun protein, dan beberapa koenzim

Penyusun asam nukleat, fosfolipida, dan koenzim

Kofaktor pada sejumlah reaksi enzim (ATP) Kofaktor pada beberapa enzim

Kofaktor pada beberapa enzim (Protease)

Penyusun sitokrom, protein, non-heme dan kofaktor pada beberapa enzim

Penyusun vitamin B12

Penyusun beberapa enzim

8 20 50 14 1 3 0.5 0.1 0.5 0.2 0.03 0.03

(33)

Umumnya yang disebut makronutrien adalah yang dibutuhkan dalam jumlah besar seperti C, H, O, N,. Mesonutrien dibutuhkan dalam jumlah lebih sedikit seperti Mg, P, S, dan mikronutrien dibutuhkan dalam jumlah sangat sedikit seperti Fe, Cu, Zn, dan Mo. (Hidayat N, dkk. 2006). Salah satu unsur yang sangat penting dalam media adalah karbon. Secara umum sumber karbon yang optimal digunakan yaitu karbohidrat, hidrokarbon dan minyak nabati. Beberapa organisme mengkonsumsi beberapa substrat, yang dikombinasi atau secara terpisah (Desai et al., 1994).

(34)

BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1Alat dan Bahan

3.1.1 Alat-alat

1. Gelas beaker Pyrex

2. Gelas ukur Pyrex

3. Gelas erlenmeyer Pyrex

4. Neraca analitik Ohaus

5. Indikator universal Merck

6. Autoklaf Yamato SN210

7. Oven Gallenkamp

8. Tabung reaksi Pyrex

9. Inkubator Fisher Cientific

10.Hot plate Thermolyne

11.Termometer

12.Labu takar Pyrex

13.Cawan Petri Pyrex

14.Jarum Ose

15.Pipet serologi Pyrex

16.Pipet Volumetri Pyrex

17.Pipet man Gilson

18.Bunsen 19.Botol akuades

20.Statif dan klem Pyrex

21.Buret Pyrex

22.Vortex Fisons

(35)

24.Spektrometric Genesis 20 Simadzu

25.Shaker Kika HS 501

26.Sentrifugasi Hettich EBA 85

3.1.2 Bahan-Bahan 1. Minyak Wijen 2. Akuades

3. Starter Pseudomonas Aeruginosa

4. Tripton Soya Agar p.a.(E.Merck)

5. NH4NO3(s) p.a.(E.Merck)

6. CaCl2.2H2O (s) p.a.(E.Merck)

7. MgSO4.7H2O (s) p.a.(E.Merck)

8. K2HPO4 (p) p.a.(E.Merck)

9. KH2PO4 (s) p.a.(E.Merck)

10.Alkohol 96% Teknis 96% (Bratachem)

11.Alkohol 70% Teknis 70% (Bratachem)

12.Na2CO3 (s) p.a.(E.Merck)

13.NaOH (s) p.a.(E.Merck)

14.Kalium Natrium Tartrat (s) p.a.(E.Merck)

15.CuSO4.5H2O (s) p.a.(E.Merck)

16.Folin Ciocalteu (l) p.a.(E.Merck)

17.Bovine Serum Albumin p.a.(E.Merck)

18.HCl (s) p.a.(E.Merck)

19.KOH (s) p.a.(E.Merck)

20.BaCl2.2H2O (s) p.a.(E.Merck)

21.H2SO4 (l) p.a.(E.Merck)

(36)

3.2 Prosedur Penelitian

3.2.1 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.2.1.1 Pembuatan HCl 0,1 N

Dimasukkan 2 mL HCl p.a ke dalam labu takar labu takar 1000 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda batas setelah itu homogenkan.

3.2.1.2 Pembuatan larutan Na2CO3 2 %

Ditimbang 2 g Kristal Na2CO3, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar

100 mL; tuangkan akuades ¼ tabung dan homogenkan; tambahkan lagi dengan akuades sampai tanda batas, homogenkan.

3.2.1.3 Pembuatan Buffer Phosfat 0,05 M untuk pH = 7 Dipakai rumus: 2 , 7 0 , 7 ] [ ] [ log 4 2 4 2 − = − HPO K PO KH ] [ ] [ log 2 , 7 0 , 7 4 2 4 2 HPO K PO KH − = ] [ ] [ log 4 2 4 2 HPO K PO KH pKa

pH = −

2 , 0 ] [ ] [ log 4 2 4 2 − = − HPO K PO KH 2 , 0 ] [ ] [ log 4 2 4 2 = HPO K PO KH 5849 , 1 ] [ ] [ 4 2 4 2 = HPO K PO KH 1 5849 , 1 ] [ ] [ 4 2 4 2 = HPO K PO KH

(37)

Gram garam = % garam x Molaritas x BM = 38,68 % x 0,05 x 174 = 0,3868 x 0,05 x 174 = 3,3652 g/L

Gram asam = % Asam x Molaritas x BM = 61,32 % x 0,05 x 136 = 0,6132 x 0,05 x 136 = 4,1698 g/L

Ditimbang 4,1698 g KH2PO4 (s) dan 3,3652 g K2HPO4 (s). % 100 % x Asam Garam Garam Garam + = % 100 5849 , 1 1 1 x + = % 100 5849 , 2 1 x = % 68 , 38 = % 100 % x Asam Garam Asam Asam + = % 100 5849 , 2 5849 , 1 x = % 32 , 61 =

(38)

3.2.1.4 Pembuatan larutan KOH 0,001 N a. Pembuatan larutan KOH 0,001 N

Ditimbang 0,056 g KOH dan dimasukkan ke dalam labu takar 250 ml, kemudian dilarutkan dengan akuades hingga tanda batas setelah itu dihomogenkan

b. Standarisasi larutan KOH 0,001 N dengan Asam Oksalat

Ditimbang dengan teliti 0,001 g asam okslat (BM=126), kemudian dilarutkan ke dalam 25 mL aquadest dan ditambahkan 3 tetes indikatot phenolphthalein kemudian dititrasi dengan larutan KOH yang akan distandarisasi hingga warna merah rose. Hal yang sama dilakuan 3 kali ulangan.

Perhitungan

(

)

(

0,126xmLKOH

)

2 x oksalat asam

g KOH larutan

N = (Sudarmaji, S. 1997)

3.2.1.5 Pembuatan larutan Magnesium Sulfat 0,02 %

Ditimbang 0.05 g MgSO4.7H2O(s), kemudian dimasukkan ke dalam labu takar

250 mL; tuangkan akuades ¼ tabung dan homogenkan; tambahkan lagi dengan akuades sampai tanda batas, homogenkan kemudian disterilkan.

3.2.1.6 Pembuatan larutan Kalium Natrium Tartrat 1 %

Ditimbang 1 g Kalium Natrium Tartrat, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL; tuangkan akuades ¼ tabung dan homogenkan; tambahkan lagi dengan akuades sampai tanda batas, homogenkan.

3.2.1.7 Pembuatan pereaksi Lowry

a. Pembuatan larutan NaOH 0,1 N

Ditimbang dengan teliti 0,4 g NaOH dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, tuangkan akuades ¼ tabung dan homogenkan; tambahkan lagi dengan akuades sampai tanda batas homogenkan.

b. Pembuatan pereaksi A

Larutan 2% Na2CO3 dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, diencerkan

(39)

c. Pembuatan pereaksi B

Ditimbang 0,5 g CuSO4.5H2O dan dilarutkan dengan larutan Kalium Natriun

Tartrat 1% dalam labu takar 100 mL hingga tanda batas setelah itu dihomogenkan.

d. Pembuatan pereaksi C

Dicampurkan pereaksi C dan pereaksi A deengan perbandingan 1:50, pereaksi ini harus dalam keadaan segar ketika akan digunakan untuk analisa.

e. Folin-Ciocalteu

Diencerkan pereaksi Folin-Ciocalteu dengan akuades dengan perbandingan 1:50 (Apriyantono. A, 1989)

3.2.1.8 Pembuatan larutan Bovine Serum Albumin (BSA) 5 mg/mL

Ditimbang dengan teliti 1,25 g BSA dan dimasukkan ke dalam labu takar 250 mL dan dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

3.2.1.9 Pembuatan Larutan standard BSA 1000 µg/mL

Dipipet 20 mL dari larutan induk BSA 5000 µg/mL dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

3.2.1.10 Pembuatan Larutan standard BSA 350 µg/mL

Dipipet 35 mL dari larutan standard BSA 1000 µg/mL dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

3.2.1.11 Pembuatan Larutan standard BSA 300 µg/mL

Dipipet 30 mL dari larutan standard BSA 1000 µg/mL dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

(40)

3.2.1.12 Pembuatan Larutan standard BSA 250 µg/mL

Dipipet 25 mL dari larutan standard BSA 1000 µg/mL dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

3.2.1.13 Pembuatan Larutan standard BSA 200 µg/mL

Dipipet 20 mL dari larutan standard BSA 1000 µg/mL dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

3.2.1.14 Pembuatan Larutan standard BSA 150 µg/mL

Dipipet 15 mL dari larutan standard BSA 1000 µg/mL dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

3.2.1.15 Pembuatan Larutan standard BSA 100 µg/mL

Dipipet 10 mL dari larutan standard BSA 1000 µg/mL dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

3.2.1.16 Pembuatan Larutan standard BSA 50 µg/mL

Dipipet 5 mL dari larutan standard BSA 1000 µ g/mL dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda setelah itu dihomogenkan.

3.2.2 Sterilisasi Alat

Dicuci alat-alat yang akan digunakan sampai bersih, kemudian dikeringkan dan ditutup rapat dengan kapas setelah itu dibalut dengan kertas. Setelah itu dimasukkan ke dalam oven. Disterilisasi sampai suhu 221oC dan dipertahankan suhu selama lebih kurang 15 menit.

(41)

3.2.3 Pembuatan Media

3.2.3.1Pembuatan Media Tripton Soya Agar

Ditimbang 4 g tipton Soya Agar setelah itu dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer dan dilarutkan dengan 100 mL air laut, kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga larut dan warna larutan berubah menjadi bening, ditutup dengan kapas dan alumunium foil.

3.2.3.2Pembuatan Media cair

Ditimbang 1,5 g NH4NO3 (s), 4,1698 g KH2PO4 (s) dan 3,3652 g K2HPO4 (s),

dimasukkan ke dalam Botol duran 500 mL, dan dipipet0,1 mL larutan MgSO4

0,02%, dilarutkan dengan akuades sampai garis batas, ditutup rapat, kemudian distirer hingga larutan menjadi homogen.

3.2.3.3Pembuatan Media cair dengan penambahan Kofaktor enzim Ca2+

Ditimbang 7,5 g CaCl2.2H2O (s), 1,5 g NH4NO3 (s), 4,1698 g KH2PO4 (s) dan

3,3652 g K2HPO4 (s), dimasukkan ke dalam Botol duran 500 mL, dan dipipet

0,1 mL larutan MgSO4 0,02%, dilarutkan dengan akuades sampai garis batas,

ditutup rapat, kemudian di stirer hingga larutan menjadi homogen.

3.2.4 Sterilisasi Media dan Bahan

Dimasukkan +/- 1 L akudes ke dalam autoklaf, kemudian disusun media dan bahan yang akan diterilkan pada keranjang alat dan dimasukkan ke dalam autoklaf. Disterilkan pada suhu 121oC pada tekanan 15 Psi selama 15 menit

3.2.5 Pembuatan starter Pseudomonas Aeruginosa

Dimasukkan media tripton yang telah steril ke dalam cawan petri sebanyak ¼ volume cawan lalu diinokulasi biakan murni bakteri Pseudomonas Aeruginosa ke dalam media tripton, yang dilakukan pada kondisi septik, selanjutnya ditutup dengan alumunium foil dan klem-bab kemudian dibalut kertas setelah itu diinkubasi dalam inkobator pada suhu 35oC selama 3-5 hari hingga terbentuk koloni baru di atasnya.

(42)

3.2.6 Pembuatan Standard Mac Varlan

Diukur 0,05 mL BaCl2 0,048 M dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi,

ditambahkan 9,95 mL H2SO4 0,35 N kemudian ditutup dengan alumunium foil

dan divortex. (Larlan,V, 1980)

3.2.7 Pembuatan Mac Varlan Bakteri Pseudomonas Aeruginosa

Dipipet 10 mL air suling steril ke dalam tabung reaksi. Diinokulasi bakteri Pseudomonas Aeruginosa ke dalam tabung setelah itu divortex dan dilakukan hal yang sama dalam kondisi septik hingga larutan bakteri sesuai dengan standar Mac Varlan.

3.2.8 Penanaman bakteri pada media cair

Dipipet sebanyak 20 mL media cair dan dimasukkan ke dalam botol essence 50 mL, kemudian dimasukkan Sebanyak 2 mL larutan Mac Varlan dari bakteri Pseudomonas Aeruginosa dan ditambahkan induser minyak wijen steril dengan konsentrasi 2 % dalam kondisi septik, ditutup rapat botol dalam keadaan terbungkus klem-bab. Dishaker media dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 72 jam. Dilakukan prosedur yang sama untuk variasi konsentrasi induser 4, 6, 8, dan 10%.

3.2.9 Penanaman bakteri pada media cair dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+

Dipipet sebanyak 20 mL media cair dengan kofaktor enzim Ca2+ dan dimasukkan ke dalam botol essence 50 mL, kemudian dimasukkan Sebanyak 2 mL larutan Mac Varlan dari bakteri Pseudomonas Aeruginosa dan ditambahkan induser minyak wijen steril dengan konsentrasi 2 % dalam kondisi septik, ditutup rapat botol dalam keadaan terbungkus klem-bab. Dishaker media dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang selama 72 jam. Dilakukan prosedur yang sama untuk variasi konsentrasi induser 4, 6, 8, dan 10%.

(43)

3.2.10 Pembuatan Ekstrak Kasar Enzim Lipase

Dipipet sebanyak 10 mL media hasil penanaman berdasarkan masing-masing konsentrasi induser dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit; didekantasi supernatan yang terbentuk. Dan diuji kadar protein dan aktivitasnya.

3.3 Parameter yang Diamati

3.3.1 Penentuan absorbansi maksimum larutan Bovine Serum Albumin 5000µg/mL

Dipipet 1 mL larutan larutan BSA 5000 µg/mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 6 mL pereaksi C Lowry dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 730 – 780 nm untuk menetukan panjang gelombang dengan absorbansi maksimum. Grafik hasil absorbansi dapat dilihat pada hasil penelitian (halaman 36-37)

3.3.2 Penentuan Kurva standard larutan Bovine Serum Albumin

Dipipet 1 mL larutan larutan dari masing-masing larutan BSA dengan konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 µg/mL dan masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dtambahkan 6 mL pereaksi C Lowry dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 775 nm kemudian dibuat kurva standarnya.

3.3.3 Penentuan Kadar Protein Ekstrak Kasar Enzim Lipase Ekstraseluler

Pseudomonas Aeruginosa

Dipipet 1 mL larutan enzim dari masing-masing supernatant tiap-tiap perlakuan dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 6 mL pereaksi C Lowry dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang

(44)

775 nm. Dihitung kadar protein dengan menggunakan kurva standar (Boyer, 1993).

3.3.4 Penentuan kadar Asam Lemak Bebas

Ditimbang sampel minyak wijen seberat 2,5 g, dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, ditambahkan 1 mL ekstrak kasar enzim lipase dan ditambahkan 25 mL Alkohol 96%, ditutup dengan plastic dan karet dan dipanaskan hingga mendidih kemudian didinginkan. Ditambahkan 3 tetes indicator Penolftalein. Kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,001 N hingga terjadi perubahan warna dari bening menjadi merah rose dan dicatat volume KOH 0,001 N yang terpakai.

(45)

3.4 Skema Penelitian

3.4.1 Skema Pembuatan Media

3.4.1.1 Skema Pembuatan Media Tripton

Dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer 250 mL Ditambahkan 100 mL air laut

Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih Didinginkan

Ditutup dengan kapas dan alumunium foil Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 15 Psi selama 15 menit.

4 g Tripton Soya Agar (s)

(46)

3.4.1.2 Skema Pembuatan Media Cair

Dimasukkan ke dalam botol duran 500 mL Ditambahkan 0,1 g MgSO4.7H2O (s)

Ditambahkan 4,1698 g KH2PO4 (s)

Ditambahkan 3,3652 g K2HPO4 (s)

Ditambahkan 500 mL akuades Dimasukkan stirrer dan Ditutup rapat

Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 15 Psi selama 15 menit

3.4.1.3 Skema Pembuatan Media Cair dengan penambahan Kofaktor enzim Ca2+

Dimasukkan ke dalam botol duran 500 mL Ditambahkan 7,5 g CaCl2.2H2O (s),

Ditambahkan 0,1 g MgSO4.7H2O (s)

Ditambahkan 4,1698 g KH2PO4 (s)

Ditambahkan 3,3652 g K2HPO4 (s)

Ditambahkan 500 mL akuades Dimasukkan stirrer dan Ditutup rapat

Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 15 Psi selama 15 menit.

1,5 g NH4NO3 (s)

Hasil 1,5 g NH4NO3 (s)

(47)

3.4.2 Skema Pembuatan starter Pseudomonas Aeruginosa

Disterilkan didalam autoklaf

Dimasukkan ke dalam cawan petri sebanyak ¼ volume cawan

Diinokulasi biakan murni bakteri Pseudomonas Aeruginosa ke dalam media tripton.

Ditutup dengan alumunium foil dan klem-bab lalu dibalut kertas

Diinkubasi dalam inkobator pada suhu 35oC selama 4-5 hari

Media Triptonl (l)

(48)

3.4.3 Skema Penanaman media untuk menghasilkan ekstrak kasar enzim 3.4.3.1 Skema Penanaman bakter pada media cair

Dipipet sebanyak 20 mL Dipipet sebanyak 2 mL

Ditambahkan induser minyak wijen dengan variasi 2%, 4%, 6%, 8%, 10%. Ditutup rapat dan dibungkus klem-bab Dishaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 25oC selama 72 jam

Disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit

Didekantasi supernatan yang terbentuk.

Dibagi dua

Diukur kadar protein Diuji aktivitasnya dengan

Dengan menggunakan penentuan kadar Asam

Spektrofotomoter UV-Visible Lemak Bebas Media cair (l) Larutan Mac Varlan Bakteri

Pseudomonas Aeruginosa (l)

Ekstrak kasar Enzim Lipase

Campuran Ekstrak dan Media

Hasil 1 mL Ekstrak

kasar enzim

Larutan Media bakteri

1 mL Ekstrak kasar enzim

Endapan sel bakteri

(49)

3.4.3.2 Skema Penanaman bakteri pada media cair dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+

Dipipet sebanyak 20 mL Dipipet sebanyak 2 mL

Ditambahkan induser minyak wijen dengan variasi 2%, 4%, 6%, 8%, 10%. Ditutup rapat dan dibungkus klem-bab Dishaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 25oC selama 72 jam

Disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit

Didekantasi supernatan yang terbentuk.

Dibagi dua

Diukur kadar protein Diuji aktivitasnya dengan

Dengan menggunakan penentuan kadar Asam

Spektrofotomoter UV-Visible Lemak Bebas Media cair dengan

kofaktor enzim

Larutan Mac Varlan Bakteri Pseudomonas Aeruginosa (l)

Ekstrak kasar Enzim Lipase

Campuran Ekstrak dan Media

Hasil 1 mL Ekstrak

kasar enzim

Larutan Media bakteri

1 mL Ekstrak kasar enzim

Endapan sel bakteri

(50)

3.4.4 Skema Parameter yang diamati

3.4.4.1 Skema Penentuan absorbansi maksimum larutan BSA 5000µg/mL

Diukur sebanyak 1 mL

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 6 mL pereaksi C Lowry Dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar

Ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu

Dikocok dan dibiarkan selama 30 menit Diukur absorbansi maksimumnya pada panjang gelombang 730 – 780 nm

3.4.4.2 Skema Penentuan Kurva standard larutan Bovine Serum Albumin

Diukur masing-masing sebanyak 1 mL Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 6 mL pereaksi C Lowry Dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar

Ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu

Dikocok dan dibiarkan selama 30 menit Diukur absorbansi pada panjang

gelombang 775 nm Larutan BSA 5000µg/mL

Hasil

Larutan BSA konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 µg/mL

(51)

3.4.4.3 Skema Penentuan Kadar Protein Ekstrak Kasar Enzim Lipase Ekstraseluler Pseudomonas Aeruginosa

Diukur masing-masing sebanyak 1 mL Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 6 mL pereaksi C Lowry Dikocok dan dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar

Ditambahkan 0,5 mL larutan Folin-Ciocalteu

Dikocok dan dibiarkan selama 30 menit Diukur absorbansi pada panjang

gelombang 775 nm

Dihitung kadar protein dengan menggunakan kurva standar Supernatan enzim lipase

(52)

3.4.4.4 Skema Penentuan Kadar Asam Lemak Bebas

Dimasukkan ke dalam gelas Erlenmeyer Ditambahkan 1 mL ekstrak kasar enzim lipase

Ditambahkan 25 mL Alkohol 96% Ditutup dengan pelastik dan karet

Dipanaskan hingga mendidih dan didinginlan

Ditambahkan 3 tetes indicator PP Dititrasi dengan KOH 0,001 N sampai terjadi perubahan warna dari bening menjadi merah rose.

Dihitung volume KOH yang terpakai 2,5 g minyak wijen

(53)

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Penelitian

Dari hasil penelitian tentang produksi enzim lipase oleh Pseudomonas aeruginosa dalam menghasilkan ekstrak kasar enzim lipase dilakukan beberapa penentuan

4.1.1. Penentuan panjang gelombang maksimum larutan BSA

Terhadap 1 mL larutan BSA 5000 µg/mL dengan metode lowry diukur absorbansinya pada panjang gelombang 720 – 780 nm. Hasilnya menunjukkan bahwa absorbansi

maksimum diperoleh pada λ 775 nm. Hasil lengkapnya adalah sebagai berikut :

Grafik 4.1.1. Penentuan panjang gelombang maksimum larutan BSA 5000 µg/mL

(54)

(55)

4.1.2. Penentuan kurva standar larutan BSA pada λ 775 nm

Larutan BSA dengan konsentrasi bertingkat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 775 nm. Hasilnya sebagai berikut :

Tabel 4.1.2. Absorbansi larutan BSA pada λ 775 nm Konsentrasi BSA (μgg/mL)

(x)

Absorbansi (y)

50 0,067

100 0,070

150 0,075

200 0,073

250 0,074

300 0,074

350 0,087

Dengan menggunakan rumus persamaan garis regresi y = ax + b diperoleh nilai

y = 0,00004(x) + 0,065 (Lampiran 1), dimana x adalah kadar ekstrak kasar enzim lipase dengan tetapan a (slope grafik) dan b (intercept) yang diperoleh dari:

( ) ( )( )

( )

₂

( )

∑

− − = x x n y x xy n a

( )( ) ( )( )

( ) ( )

₂ 2 2

∑

− − = x x n xy x y x b

4.1.3 Penentuan kadar protein enzim lipase dari Pseudomonas aeruginosa

Terhadap supernatant dari biakan Pseudomonas aeruginosa yang ditumbuhkan pada media dengan konsentrasi minyak wijen yang berbeda maka didapat masing – masing absorbansi dari tiap konsentrasi (lampiran 2) yang berbeda juga, sehingga diperoleh

(56)

hasil kadar enzim dengan menggunakan persamaan garis regresi y = 0.00004 (x) + 0.065 yaitu sebagai berikut :

Tabel 4.1.3 Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 %.

Perlakuan

Kadar protein Enzim (μg/mL) Konsentrasi

2 % 4 % 6 % 8 % 10 %

Perulangan I 10550 27700 47825 67025 60375

Perulangan II 3550 4950 5800 7752 6250

Perulangan III 4000 4225 5875 16250 11550

Rata-rata 6033,33 12291,67 19833,33 30342,33 26058,33

4.1.4 Penentuan kadar protein enzim lipase dengan penambahan Ca2+

Pada media biakan yang ditumbuhi Pseudomonas aeruginosa ditambahkan ion Ca2+ sebagai Kofaktor enzim dengan konsentrasi 1.5% pada setiap setiap konsentrasi substrat yang berbeda, yang pengukuran absorbansinya pada setiap konsentrasi dapat dilihat pada (lampiran III) sehingga diperoleh hasil kadar enzim dengan menggunakan persamaan garis regresi sebagai berikut :

Tabel 4.1.4 Kadar protein enzim (μg/mL) pada setiap perlakuan untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 % dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+.

(57)

Konsentrasi substrat

2 % 4 % 6 % 8 % 10 %

Perulangan I 5400 5825 29800 35550 55775

Perulangan II 3900 3850 5800 6075 11875

Perulangan III 4775 4850 5025 5225 5525

Rata-rata 4691,67 4841,67 13541,67 15616,67 24391,67

4.1.5. Uji aktivitas

Uji aktivitas terhadap ekstrak kasar enzim lipase dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim dalam menggunakan asam lemak pada minyak normal. Pengukuran kadar ALB (%) dilakukan dengan metode titrimetri dengan titran KOH. Uji aktivitas pada ekstrak kasar enzim lipase tersebut diukur berdasarkan perbedaan kadar asam lemak bebas dengan menggunakan: % 100 1000 × ×× × = Sampel Berat ALB BM KOH mL KOH N ALB Kadar

N KOH merupakan normalitas KOH yang digunakan ( 0,001 N) Volume KOH adalah volume hasil titrasi

BM ALB adalah berat molekul ALB yang dihitung sebagai Oleat (Mr = 282)

Berat sampel merupakan berat dari minyak wijen yang diukur kadar ALB-nya, dan penentuan aktivitas dalam unit dinyatakan dengan,

sehingga diperoleh hasil sebagai berikut :

Tabel 4.1.5.1. Aktivitas ekstrak kasar Enzim Lipase Sampel Ekstrak kasar Enzim (%) Berat Wijen (gram) Volume KOH (mL)

Rata - rata

Kadar ALB (g ALB/g Minyak)

Unit

x 10-4

(µmol/menit)

I II III

(

menit

)

Mr ALB Kadar Unit 6 10 × =

(58)

Untuk uji aktivitas pada ekstrak kasar enzim lipase yang menggunakan kofaktor enzim Ca2+ diukur dengan cara yang sama yatu berdasarkan perbedaan kadar asam lemak bebas pada minyak wijen setelah penambahan enzim lipase yang mengandung kofaktor enzim Ca2+ sehingga diperoleh hasil sebagai berikut :

Tabel 4.1.5.2. Aktivitas ekstrak kasar Enzim Lipase dengan menggunakan kofaktor enzim Ca2+

Ekstrak kasar Enzim

(%)

Berat Wijen (gram)

Volume KOH (mL)

Rata - rata

Kadar ALB (g ALB/g Minyak)

Unit

x 10-4

µmol/menit

I II III

2 2,5 6,8 6,9 6,5 6,73 0,0759 6,23

4 2,5 7,5 7,6 7,5 7,57 0,0854 7,01

6 2,5 7,5 7,6 7,6 7,57 0,0854 7,01

8 2,5 9,6 9,8 9,6 9,67 0,1091 8,96

10 2,5 12,6 12,8 12,2 12,53 0,1413 11,60

4.2. Pembahasan Hasil Penelitian

Grafik berikut memperlihatkan hubungan antara hasil ekskresi enzim oleh Pseudomonas aeruginosa dengan penambahan substrat dengan konsentrasi yang berbeda dan perbedaan kadar enzim pada masing – masing perlakuan dapat dilihat pada grafik dibawah ini.

2 2,5 8,2 8,3 8,9 8,5 0,0959 7,87

4 2,5 9,2 8,7 9,0 8,9 0,1004 8,24

6 2,5 8,8 8,9 9,1 8,9 0,1004 8,24

8 2,5 9,5 9,8 9,0 9,1 0,1026 8,42

10 2,5 8,8 8,7 8,8 8,8 0,0992 8,14

550 950 800 752 250 000 225 875 16250 550 550 700 825 67025 60375₆₀₀₀₀ 70000 80000 12000 14000 16000 18000 ( μ g /m L)

Kadar enzim (

μ

g/mL) pada setiap perlakuan

untuk konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 %.

(59)

Grafik 4.2.1

Dari hasil di atas secara keseluruhan dapat diketahui bahwa kadar enzim pada semua perlakuan berbeda – beda, dimana kadar ekstrak kasar enzim tertinggi diperoleh pada perlakuan konsentrasi substrat minyak wijen 8%, baik pada perlakuan I, perlakuan II, dan perlakuan III yang masing – masing yaitu 67025 μg/mL, 7752

μg/mL, 16250 μg/mL yang berbeda sangat nyata dibandingkan dengan konsentrasi

awal penambahan substrat. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas metabolisme Pseudomonas aeruginosa yang tertinggi pada masa inkubasi optimum-nya selama 72 jam (Priyani, N, 2001) dapat dicapai dengan konsentrasi penambahan substrat sebanyak 8%. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh beberapa hal antara lain.

Konsentrasi substrat 8% merupakan konsentrasi optimum bagi Pseudomonas aeruginosa untuk menghasilkan enzim lipase ekstrasel dimana selama waktu perulangan tetap menunjukkan bahwa pada konsentrasi substrat 8% bakteri menghasilkan lipase secara maksimal. Hal ini ditunjukkan oleh kadar enzim yang mengalami penurunan pada konsentrasi substrat 10%, pada konsentrasi ini kemungkinan lapisan minyak cukup menghalangi difusi oksigen ke dalam media yang dapat mengganggu metabolisme bakteri (Wardhana, 1995) mengingat minyak yang tersedia masih cukup dan Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri aerob yang sangat membutuhkan oksigen dalam kelangsungan proses metabolismenya (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya,2003) sehingga membuat hasil sekresi enzim menurun pada konsentrasi 10%.

(60)

Grafik berikut memperlihatkan hubungan antara hasil ekskresi enzim oleh Pseudomonas aeruginosa pada substrat dengan adanya penambahan kofaktor enzim Ca2+. Untuk lebih jelasnya perbedaan kadar enzim pada masing – masing perlakuan dapat dilihat pada grafik dibawah ini:

Grafik 4.2.2

Dari hasil di atas pada setiap perlakuan terjadi peningkatan kadar enzim yang di sekresikan oleh bakteri Pseudomonas aeruginosa hingga pada konsentrasi substrat 10% pada waktu inkubasi yang sama, tetapi berbeda sangat nyata pada penambahan substrat dengan konsentrasi 2%

Pada penambahan substrat konsentrasi 2% terjadi kompetisi terhadap substrat yang tersedia cukup sedikit sehingga menyebabkan kematian sebagian sel, sedangkan bakteri yang survive tetap menunjukkan aktivitas metabolisme yang ditandai dengan tetap terjadi produksi enzim tetapi tidak terlalu nyata.

Dengan penambahan kofaktor enzim ini terjadi peningkatan kadar enzim sesuai dengan yang diharapkan dimana terjadi peningkatan secara terus menerus, hal ini disebabkan oleh kofaktor dari ion logam Ca2+ dalam konsentrasi yang rendah akan mengaktifkan reaksi enzimatik lipase (Malcolm, D, 1964).

3900 3850

5800 6075

11875

4775 4850 5025

5225 5525 5400 5825 29800 35550 55775 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 K a d a r e n zi m ( μ g / m L ) Konsentrasi (%)

Kadar enzim (

μ

g/mL) pada setiap perlakuan untuk

konsentrasi substrat 2, 4, 6, 8, 10 % dengan

penambahan koenzim Ca2+

Perulangan II Perulangan III Perulangan I

(61)

Pada beberapa mikroorganisme seperti Rhizopus japanicus sebagian besar enzim lipase ekstrasel tidak dilepas ke dalam medium sehingga dengan perlakuan khusus yaitu penambahkan ion magnesium ke dalam media pertumbuhan berhasil dapat menstimulasi pelepasan lipase ektraseluler dari dinding sel mikroorganisme sehingga dapat meningkatkan pembentukan lipase (Aisaka & Terada, 1979).

Pada setiap jenis minyak nabati, kecenderungan berkurangnya tingkat kadar asam lemak bebas pada minyak apabila ditambahkannya enzim lipase pada minyak merupakam korelasi yang menunjukkan adanya aktivitas dari enzim lipase.

Berikut adalah grafik dari aktivitas enzim lipase dari setiap sampel hasil ekskresi Pseudomonas aeruginosa yang berbeda pada setiap minyak normal yang ditunjukkan dari kadar ALB (%) untuk masing – masing perlakuan dapat dilihat pada grafik dibawah ini:

Grafik 4.2.3

Sedangkan untuk grafik dari aktivitas enzim lipase dari setiap sampel hasil ekskresi Pseudomonas aeruginosa yang berbeda pada setiap minyak normal yang ditambahkan pada minyak wijen normal yang ditunjukkan dari kadar ALB (%) untuk masing – masing perlakuan dapat dilihat pada grafik dibawah ini:

(62)

Grafik 4.2.4

Dari dua grafik di atas dapat dilihat adanya perbedaan yang nyata antara aktivitas ekstrak kasar enzim lipase tanpa penambahan kofaktor enzim Ca2+ dan aktivitas dari ekstrak kasar enzim lipase yang mengandung kofaktor enzim Ca2+ .

Pada grafik 4.2.1 terlihat peningkatan aktivitas ekstrak kasar enzim lipase pada konsentrasi 8%, sebanding dengan peningkatan jumlah produksi kadar enzim pada konsentrasi tersebut dimana kesebandingan tersebut ditunjukkan dengan terjadinya peningkatan kadar asam lemak bebas pada konsentrasi yang sama yaitu kadar enzim tertinggi diperoleh pada perlakuan konsentrasi substrat minyak wijen 8%, baik pada perlakuan I, perlakuan II, dan perlakuan III yang masing – masing yaitu 67025

μg/mL, 7752 μg/mL, 16250 μg/mL.

Menurut Girindea, (1993), kecepatan reaksi bergantung pada konsentrasi enzim yang berperan sebagai katalisator dalam reaksi. Kekhasan suatu reaksi yang dikatalisis oleh enzim pada terbentuknya terlebih dahulu kompleks anzim substrat (ES), yang kemudian terurai lagi menjadi enzim dan produknya (E dan P). dan menurut Schwimmer, S, (1981) enzim lipase (triasilgliserol [TAG] hydrolase EC 3.1.1.3) yang menghidrolisis minyak sebagai penyebab terbentuknya asam lemak bebas. reaksi umum sebagai berikut :

(63)

O CH2O-C-R’ Lipase CH₂O-H

R2-C-O-CH + 3 H2O H-O-CH + 3RCOOH

CH2O-C-R3 CH2O-H

Trigliserida Gliserol Asam Lemak

Bebas

Menurut Nishio, (1987), Enzim lipase atau lengkapnya triasilgliserol lipase adalah enzim yang menghidrolisis ester karboksilat. Enzim ini mempunyai substrat alami berupa trigliserida dari asam lemak.

Sedangkan pada grafik 4.2.2 terlihat peningkatan % kadar asam lemak bebas hingga konsentrasi 10%. Menurut Lehninger, (1998), aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa factor yaitu: pH, konsentrasi enzim, suhu, dan adanya aktivator atau inhibitor. Dalam hal ini activator yang digunakan adalah ion Ca2+, sehingga dapat dilihat bahwa dengan adanya penambahan kofaktor enzim sebagai aktivator dari enzim lipase, aktivitas enzim terus meningkat hingga konsentrasi 10 %.

Karena menurut Soeharsono, (1989), dalam aktivitasnya enzim membutuhkan kofaktor yang bisa berupa senyawa organik atau logam dan menurut Schwimmer, S. (1981), pada enzim lipase dengan adanya ion logam Ca2+ dalam konsentrasi yang rendah akan mengaktifkan reaksi enzimatik lipase. Fungsi dari ion logam tersebut pada semua enzim, mencakup: a) secara tepat menjadi katalis pada enzim, b) Berpartisipasi dalam ikatan substrat pada sisi active, c) menjaga konformasi enzim agar tetap sebagai katalis, dan d) berpartisipasi dalam reaksi redoks.(Milton, S. H. 1987).

(64)

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa konsentrasi optimum untuk produksi ekstrak kasar enzim lipase ekstrasululer dari Pseudomonas aeruginosa dengan menggunakan induser minyak wijen adalah 8%. dimana ditandai dengan kadar protein tertinggi yaitu 30342,33 μg/mL, dengan kadar asam lemak bebas yaitu 0,1026 %

2. Pada penambahan koenzim Ca2+ kedalam masing-masing media bakteri, produksi ekstrak kasar enzim lipase (μg/mL) meningkat hingga konsentrasi 10% dan aktivitas enzim mengalami peningkatan dalam menguraikan asam lemak menjadi asam lemak bebas dari konsentrasi 2% - 10% yaitu 0,0759% - 0,1413%.

5.2 Saran

Sebaiknya penelitian ini dilanjutkan dengan lebih memurnikan enzim lipase ekstraseluler yang didapat dari ekskresi bakteri Pseudomonas aeruginosa agar didapat hasil hasil yang lebih akurat dan enzim yang lebih murni, sehingga dapat diaplikasikan lebih lanjut.

(65)

DAFTAR PUSTAKA

Aisaka, K. & Terada, O. (1979). Agricultural and Biological Chemistry. 43: hal.2125. Abigor, R.D., P.O.Uadia., T.A. Foglia, M.J, Hass, K. Scott dan B.J. Savary. (2002).

Partial and Properties of Lipase from Germaning Seeds of Jatropha curcas, L. J. Am Oil.Chem.Soc, 79: hal.1123-1126.

AOCS, 1989. Official Mothods and Recommended Practices of the American Oil Chemist Society. Champaign: Edited by D. Firestone.

Apriantono, A. 1989. Analisa Pangan. Bogor: Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Pusat Antar Universitas Pangan Dan Gizi Institut Pertanian Bogor.1:hal.74-76.

Bailey, A. E. 1951. Industrial Oil and Fat Production. New York: Interscholastic Publishing Inc.

Boyer, R.F. 1993. Modern Experimental Biochemistry. Second Edition. California: The Benjamin Cummings Company Inc.

Chen, S.Y., Lu WB., Wei YH., Chen WM., and Chang JS. 2007. Improved production of biosurfactant with newly isolated Pseudomonas aeruginosa S2.Biotechnol prog.23(3):661-663.

Desai, A.J., Reena, M.P. and Desai, J.D. 1994. Advances in the Production of

Biosurfactants and Their Commercial Applications. Journal Scientific &

Industrial Research. 53:hal.619-629.

Donnel, A. G. O. and Flow. 1994. Handbook of New Bacterial Systematics. Harcourt Brace and London: Academic Press.

Girindra, A. 1990. Biokimia 1. Cetakan ke-2. Jakarta: PT Gramedia.

Gupta, V. K. 2008.

Immobilization of Lipase by Entrapment in Ca-alginate

Beads. Bioactive and Compatible Polymers. 23(6):hal.552-562.

Hidayat, N. Masdiana, C. Padaga, C. 2006. Mikrobiologi Industri. Edisi pertama. Yogyakarta: Andi Offset.

Handajani, Sri., (2006), “Potensi Agribisnis Komoditas Wijen”, Penerbit Andi, Yogyakarta.

(66)

Hilditch, T. P. 1947. The Industrial Chemistry of The Fats and Waxes. New York: D. Van Nostrand Corporation Inc.

Ketaren, S. 1986. Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan. Cetakan I. Jakarta: UI-Press.

Koch, A.K., O. Cappeli, A. Fiechter, and J. Reiser.. 1991. Hydrocarbon assimilation and biosurfactant production in Pseudomonas aeruginosa mutants. J. Bacteriol.173:4212-4219.

Larlan, V.M.D. 1980. Antibiotic in Laboratory Medicine. London: Williams & Wilkinson.

Lehninger, A. L. 1982. Principles of Biochemistry. New York:Worth Publisher. Lehninger, A. L. 1998. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Penerbit Erlangga. Malcolm, D.1964.Enzymes.Second Edition.New York:Academic Press.

Mc Clay, K. B. G. Fox and R. J. Steffan. 1996. Chloroform Mineralization by toluene-Oxidizing Bacteria. App. And Env. Microbial. 62:hal.2716-2722.

Milton, S. H. 1987. Enzymes in Metabolic Pathway. First edition. New York: Harper and Row Publishers Inc.

Nishio, T., T. Chikano, and M. Kamimura. 1987. Triacylgliserol dalam Enzyme Handbook Springer-Verlag, Berlin.

Priyani, N. 2001. Produksi Enzim Lipase Ekstraseluler Oleh Pseudomonas sp, Pengaruh Konsentrasi Substrat yang Diberikan dan Waktu Penguraian limbah Minyak Kelapa Sawit.Indonesia:Universitas Sumatera Utara.

Rita, R, Colwell, George, M, et all. 1989. Catalogue of Bacteria & Bacteriophages. 17th edition. America: American type culture collection.

Schwimmer, S. 1981. Source Book of Food Enzymology, West Port: The AVI Publishing Co. Inc.

Shahib, N. 1992. Pemahaman Seluk Beluk Biokimia dan Penerapan Enzim. Bandung: Penerbit PT. Citra Adtya Bakti.

Soeharsono, M.T. 1989. Biokimia. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.

Soumanou, M.M. 1997. Synthesis of Structured Triglicerides from Peanut Oil with Immobilized lipase. America:JAOCS.

Sudarmadji, S. 1997. Prosedur Analisa untuk Bahan Makanan Pertanian. Yogyakarta:Liberty.

(67)

Syakti, A. D. 2005. Multi-proses Remediasi di dalam Penanganan Tumpahan Minyak (Oil Spill) di Perairan Laut dan Pesisir. Seminar Bioremedasi. Pusat Kajian Sumber Daya Pesisir dan lautan. Institut Pertanian Bogor. 10 Desember 2005. Tim Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. 2003. Bakteriologi

Medik. Malang:Bayumedia Publishing.

Trevar, P. 1985. Understanding Enzymes. Second Edition. Chicester-England:Ellis Harwood.

Velasco-Arjona, A. et al. 1998. A Fully Robotic Methods for Determination of Acid Value in Olive Oil Without Titrtion. America: American Oil Chemist Society. Wardhana, W. A. 1995. Dampak Pencemaran Lingkungan. Yogyakarta:Andi Ofset. Warsito, K.2009.Isolasi dan Potensi Bakteri Penghasil Biosurfaktan dari laut sibolga

dan Tanjung Balai Sumatera Utara Dalam Mendegradasi Naftalen.Indonesia:Universitas Sumatera Utara.

Wischnak, C. F. E. Loffler, J. Lie, J. W. Urbance and R. Muller. 1998. Pseudomonas sp. Strain 273, an aerobic, dichloroalkana degrading bacterium. App and Env. Microbiol. 64:hal.3507-3511.

(68)

(69)

Lampiran 1. Penentuan kurva standar pada λ 775 nm

Konsentrasi BSA (μgg/mL)

(x)

Absorbansi

(y) (x2) (xy)

50 0,067 2500 3.35

100 0,070 10000 7

150 0,075 22500 11.25

200 0,073 40000 14.6

250 0,074 62500 18.5

300 0,074 90000 22.2

350 0,087 122500 30.45

∑x = 1400 ∑y = 0,52 ∑x2

= 350000 ∑xy = 107.35

( ) ( )( )

( )

₂

( )

∑

− − = x x n y x xy n

( )

( ) ( )( )

( )

₂

( )

2 2

∑

− − = x x n xy x y x b

(

) (

)( )

(

) (

)

1400 350000 7 52 , 0 1400 35 , 107 7 − − =

(

)( ) (

)(

)

(

) (

)

1400 350000 7 35 , 107 1400 52 , 0 350000 − − = b 490000 728 45 , 751 − = a 490000 150290 182000− = b 490000 45 , 23 = a 490000 31710 = b 00004 , 0 =

a b=0,065

Persamaan garis regresi : y = ax + b

(70)

(1)

c. Absorbansi sampel pada λ 775 nm, Perulangan III Konsentrasi minyak Wijen (%) Absorbansi Ulangan

Rata - rata

1 2 3

2 0.220 0.227 0.227 _0.225

4 0.230 0.234 0.237 _0.234

6 0.300 0.300 0.300 _0.300

8 0.714 0.713 0.717 _0.715

10 0.525 0.525 0.530 _0.527

Lampiran 3. Absorbansi ekstrak kasar enzim lipase dengan penambahan

kofaktor enzim Ca2+ pada konsentrasi minyak wijen 2, 4, 6, 8, 10 %

a. Absorbansi sampel pada λ 775 nm, Perulangan I Konsentrasi

minyak Wijen (%)

Absorbansi Ulangan

Rata - rata

1 2 3

2 0.283 0.262 0.297 _0.281

4 0.303 0.296 0.294 _0.298

6 1.257 1.196 1.317 _1.257

8 1.476 1.486 1.499 _1.487

(2)

b. Absorbansi sampel pada λ 775 nm, Perulangan II Konsentrasi minyak Wijen (%) Absorbansi Ulangan

Rata - rata

1 2 3

2 0.221 0.221 0.221 _0.221

4 0.216 0.220 0.220 _0.219

6 0.296 0.297 0.298 _0.297

8 0.307 0.308 0.309 _0.308

10 0.540 0.540 0.541 _0.540

c. Absorbansi sampel pada λ 775 nm, Perulangan III Konsentrasi

minyak Wijen (%)

Absorbansi Ulangan

Rata - rata

1 2 3

2 0.248 0.262 0.258 _0.256

4 0.258 0.259 0.259 _0.259

6 0.265 0.267 0.266 _0.266

8 0.275 0.273 0.275 _0.274

10 0.287 0.285 0.287 _0.286

Dengan menggunakan persamaan garis regresi y = ax + b dimana : y adalah nilai absorbansi (Abs)

x adalah kadar enzim a = 0.00004 (Slope kurva) b = 0.065 (Intercept)

(3)

Lampiran 4. Penentuan kadar Asam Lemak Bebas pada ekstrak kasar enzim lipase pada minyak wijen.

a. Pengukuran Dengan Metode Titrasi.

Sampel Crude kasar Enzim

(%)

Volume KOH (mL) Perulangan

Rata - rata

1 2 3

2 8,2 8,3 8,9 8,5

4 9,2 8,7 9,0 8,9

6 8,8 8,9 9,1 8,9

8 9,5 9,8 9,0 9,1

10 8,8 8,7 8,8 8,8

b. Pengukuran pada minyak wijen.

Sampel

Volume KOH (mL) Perulangan

Rata - rata

1 2 3

Minyak Wijen 3.6 3.5 3.2 _3.4

(4)

Lampiran 5. Penentuan kadar Asam Lemak Bebas pada ekstrak kasar enzim lipase dengan penambahan kofaktor enzim Ca2+ pada minyak wijen

a. Pengukuran Volume KOH Dengan Metode Titrasi.

Sampel Crude kasar Enzim

(%)

Volume KOH (mL) Perulangan

Rata - rata

1 2 3

2 6,8 6,9 6,5 6,73

4 7,5 7,6 7,5 7,57

6 7,5 7,6 7,6 7,57

8 9,6 9,8 9,6 9,67

(5)

Lampiran 6. Gambar penelitian

Gambar a. Pure culture Pseudomonas aeruginosa

(6)

Gambar d. Hasil biakan Pseudomonas aeruginos pada media cair dengan penambahan koenzim Ca2+.