3.
Inhibition concentration 50 IC
50
adalah nilai konsentrasi ekstrak etanol buah cabai rawit hijau yang mampu menangkap 50 radikal DPPH.
D. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat penetitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah vortex, spektrofotometer UV-VIS, alat soxhlet, densitometer,
blender
, corong
Buchner
,
oven
, mikropipet 10-1000 µl; 1-10 mL, neraca analitik,
vaccum rotary evaporator
,
waterbath
, tabung reaksi tertutup, bejana kromatografi dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.
2. Bahan penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah cabai rawit hijau
Capsicum frutescens
L. yang tidak ditentukan ukurannya dan di dapat dari pasar Beringharjo, Yogyakarta. Bahan kimia kualitas farmasetis
berupa akuades. Bahan kimia kualitas pro analitik meliputi etanol 96, silika gel 60 F
254
DPPH dan aluminium foil.
E. Tatacara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi sampel buah cabai rawit hijau yang digunakan berdasarkan ciri morfologinya dilakukan dengan membandingkan literatur
dari Bosland, Bailey, Iglesias-Olivas 1996.
2. Pengumpulan bahan
Buah cabai rawit hijau diperoleh dari seorang pedagang di Pasar Beringharjo, Yogyakarta.
3. Pembuatan ekstrak etanol buah cabai rawit hijau
Buah cabai rawit hijau sebanyak 1 kg yang masih segar dibersihkan dan dicuci kemudian dibuang tangkainya, buah cabai rawit hijau dikeringkan
pada
oven
dengan suhu 50°C kemudian dihaluskan menggunakan
blender
. Serbuk yang diperoleh ditimbang sebanyak 25 g dan dibungkus dengan kertas
saring. Simplisia yang telah dibungkus, dimasukkan ke dalam labu alas bulat berisi 350 mL etanol p.a. Soxhletasi dilakukan pada suhu 70°C selama 8 jam
sampai diperoleh hasil ekstrasi jernih. Filtrat hasil ekstraksi diuapkan dengan menggunakan
vacuum rotary evaporator
.
4. Penentuan aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit hijau
dengan metode DPPH
a. Pembuatan larutan DPPH, sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan ke dalam
etanol p.a 100,0 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan aluminium foil dan harus selalu
dibuat baru. b.
Pembuatan larutan stok kapsaisin, sebanyak 2,5 mg kapsaisin dimasukkan dalam labu takar 10,0 mL dan dilarutkan dengan etanol p.a sampai batas.
c. Pembuatan larutan seri baku kapsaisin, diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0
dan 5,0 mL larutan stok kapsaisin, kemudian ditambahkan etanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku kapsaisin
sebesar 25,0; 50,0; 75,0; 100,0 dan 125,0 µgmL. d.
Pembuatan larutan uji, ditimbang sebanyak 25 mg ekstrak etanol buah cabai rawit hijau dan ditambahkan etanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil
sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 dan 5,0 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan etanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi
larutan uji sebesar 100,0; 200,0; 300,0; 400,0 dan 500,0 µgmL. e.
Uji pendahuluan aktivitas antioksidan, sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing
dengan 1 mL etanol p.a, larutan baku kapsaisin 75,0 µgmL, dan larutan uji 300 µgmL. selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3,0 mL
etanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu di diamkan selama 30 menit dan amati warna pada larutan tersebut.
f. Penentuan
operating time OT
, sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tiga labu ukur 5,0 mL, ditambahkan masing-masing
dengan 1 mL larutan baku kapsaisin 25,0; 75,0 dan 125,0 µgmL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda
batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang
gelombang 517 nm setiap 5 menit selama 1 jam.
g. Penentuan panjang gelombang maksimum
λmaks, pada tiga labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0 dan 1,5 mL larutan DPPH.
Ditambahkan ke dalam larutan tersebut dengan etanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040 dan 0,080 mM.
Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Didiamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum
dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. h.
Penentuan aktivitas antioksidan 1
Pengukuran absorbansi larutan DPPH kontrol, pada labu ukur 5 mL, dimasukkan sebanyak 1,0 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan
tersebut dengan etanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang
maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan baku dan uji.
2 Pengukuran absorbansi larutan baku dan uji, sebanyak 1 mL larutan
DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL kemudian ditambah dengan 1 mL larutan baku dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah
dibuat. Selanjutnya, larutan tersebut ditambah dengan etanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30
detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum.
Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali.
i. Validasi metode uji aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h 1 dan 2
divalidasi akurasi
recovery
, presisi
CV
, spesifisitas spectra kontrol dan linieritas nilai r.
recovery
=
jumlah analit terukur jumlah analit teoritis
x 100 1 Harmita, 2004.
CV
=
s rata-rata
x 100 2 Harmita, 2004.
j. Estimasi aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h 1 dan 2 dihitung
nilai
IC
dan
IC
50
untuk kapsaisin dan ekstrak etanol buah cabai rawit hijau.
5. Penetapan kadar kapsaisin
a. Pembuatan fase gerak, fase gerak yang digunakan pada penelitian ini yaitu
campuran toluen - kloroform - aseton 45:25:30
v v
. Fase gerak dituang dalam bejana kromatografi kemudian kertas saring dimasukkan dalam
bejana yang berisi fase gerak. Bejana ditutup rapat dan dibiarkan hingga seluruh kertas saring terbasahi oleh fase gerak.
b. Pembuatan larutan stok kapsaisin, baku kapsaisin ditimbang seksama
sebanyak 1,0 mg dan dimasukkan dalam labu takar 10 mL, kemudian dilarutkan dengan metanol sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan
stok kapsaisin 0,1 mgmL. c.
Pembuatan larutan seri baku kapsaisin, larutan stok kapsaisin ditotolkan dengan volume 1,25; 2,5; 5; dan 10 µl pada lempeng silika gel 60 F
254
sehingga diperoleh seri baku kapsaisin 0,125; 0,25; 0,5; dan 1,0 µg.
d. Pembuatan larutan uji, sejumlah 50,0 mg ekstrak etanol buah cabai rawit
hijau ditimbang seksama kemudian dilarutkan dengan metanol sebanyak 500 µl. Larutan tersebut di
vortex
selama 10 menit dengan pemanasan diatas
waterbath
pada suhu 60ºC. kemudian larutan disentrifugasi selama 2 menit dan disaring dengan ayakan mesh 60. Larutan uji dibuat replikasi
sebanyak 3 kali. e.
Penetapan kadar kapsaisin ekstrak etanol buah cabai rawit hijau, sebanyak 1
0 L larutan uji ditotolkan pada lempeng silika gel F
254
, kemudian dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan
fase gerak toluene - kloroform - aseton 45:25:30
v v
. Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm, lempeng silika kemudian dikeluarkan dan
ditunggu hingga kering. Bercak diamati di bawah lampu UV 254 nm kemudian dianalisis dengan densitometer pada panjang gelombang
maksimum. Bercak seri baku kapsaisin diukur AUC-nya dengan densitometer pada panjang gelombang yang telah diperoleh. Puncak
kromatogram dan nilai AUC yang muncul diamati. Dengan metode regresi linier, nilai seri kadar µgmL diplotkan terhadap nilai AUC masing-
masing seri larutan baku sehingga diperoleh persamaan y = bx + a dimana y merupakan nilai respon AUC, x merupakan konsentrasi senyawa baku,
a adalah
intersep
dan b adalah
slope
. Kadar kapsaisin dalam sampel ditentukan berdasarkan persamaan kurva baku yang paling baik.
F. Analisis hasil
