3.5.3.2 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak batang siwak dalam etanol ditimbang menggunakan electronic balance
dan massaya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth MHB. Mula-mula dilarutkan 200
miligram ekstrak etanol kental batang siwak ke dalam 1 ml MHB untuk mendapatkan konsentrasi 20 ekstrak etanol batang siwak. Kemudian diambil setengah dari
konsentrasi 20 dan dilarutkan dalam 1 ml MHB agar diperoleh konsentrasi 10, dan seterusnya sampai didapat konsentrasi 1,25. Masing-masing konsentrasi
dimasukkan ke dalam tabung dan diberi label. 3.5.3.3
Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Mueller Hinton Agar
MHA. Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam petri 20 mlpetri lalu media disterilkan dalam autoklaf selama
15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121
o
C. Kemudian media dimasukkan ke dalm inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau
tidak. Jika steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan specimen Lampiran 3.
3.5.3.4 Pembiakan Spesimen
E.faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel E. faecalis ATCC 29212
yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil
beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9 hingga konsentrasi 10
6
CFUml CFU: Colony Forming Unit atau setara dengan 0,5 Mc Farland Standard
Lampiran 3.
3.5.3.5 Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ekstrak etanol batang siwak yang diuji dalam penelitian ini adalah 20, 10, 5, 2,5, dan 1,25. Dari masing-masing konsentrasi ekstrak etanol
batang siwak dari pengenceran yang telah dilakukan tersebut, diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan
menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian dicampur dengan vortex, lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam pada inkubator CO
2
. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan bantuan spektrofotometer, lalu dibandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol
untuk menentukan nilai KHM. 3.5.3.6
Penentuan KBM Bahan Coba
Penentuan KBM bahan coba dilakukan dengan melakukan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode Drop Plates Miles Mesra yaitu ekstrak etanol
batang siwak 20, 10, 5, 2,5, dan 1,25. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan KHM, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas dicampur dengan
vortex dan diambil 50 µl dengan mikropipet untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke
dalam MHA Lampiran 4, dilakukan 5 kali replikasi, diamkan selama 15-20 menit. Setelah mengering diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37
o
C selama 24 jam. Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan
pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri Lampiran 5. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni
bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali.
Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka
faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan
faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil standar CFUml. Contoh cara penghitungan koloni bakteri pada bahan coba dengan metode Drop Plate Miles
Mesra adalah:
a. Ambil 50 µl bahan coba dengan mikropipet dan diteteskan pada MHA. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada media dihitung.
b. Jika tetesan berjumlah 5 koloni, maka jumlah kuman pada sampel cair tersebut adalah 5 x 1 faktor pengenceran x 20 faktor pengali = 100 CFUml.
3.6 Pengolahan dan Analisis Data
Kategori