2.4 Pemeriksaan Kualitatif dan Kuantitatif Rhodamin B
Analisis Kualitatif Rhodamin B dapat dilakukan dengan beberapa cara seperti Kromatografi Lapis Tipis KLT dan Spektrofotometer Sinar Tampak,
untuk analisis kuantitatif Rhodamin B dilakukan secara Spektrofotometer Sinar Tampak.
2.4.1 Metode Kromatografi Lapis Tipis KLT
Kromatogafi Lapis Tipis KLT adalah metode kromatografi cair yang paling sederhana. Kromatografi Lapis Tipis KLT yang dapat dipakai dengan dua
tujuan. Pertama, digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Untuk meyakinkan identifikasi dapat dilakukan dengna menggunakan lebih dari 1 fase
gerak dan jenis semprot. Teknik spiking dengan menggunakan senyawa baku yang telah diketahui sangat dianjurkan untuk lebih memantapkan pengambilan
keputusan identifikasi senyawa. Kedua digunakan untuk analisis kuantitatif dengan KLT. Pertama bercak diukur langsung pada lempeng dengan
menggunakan ukuran luas atau densitometri. Cara kedua adalah dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut
dengan metode analisis lain, misalkan dengan metode spektrofotometri Rohman, 2007.
Analisis kualitatif Rhodamin B dengan menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis BPOM, 2000 dengan prinsip membandingkan harga
Rf, jika dilihat secara visual berwarna merah jambu dan jika dilihat dibawah sinar UV 254nm berfluoresensi kuning.
Universitas Sumatera Utara
Faktor–faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf:
a. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
b. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya
c. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
d. Pelarut dan derajat kemurnian fase gerak
e. Derajat kejenuhan dari uap dalam bejana pengembangan yang digunakan
f. Teknik percobaan
g. Jumlah cuplikan yang digunakan
h. Suhu
i. Kesetimbangan Hardjono, 1985.
2.4.2 Metode Spektrofotometri Sinar Tampak
Analisis kualitatif dan kuantitatif Rhodamin B dapat dilakukan dengan metode spektrofotometer sinar tampak BPOM, 2006. Untuk analisis kualitatif
Rhodamin B dengan menggunakan spektrofotometer sinar tampak yaitu dengan membandingkan kurva absorbansi yang diukur secara spektrofotometer sinar
tampak pada panjang gelombang 450-750nm kenkel, 1994 dan untuk analisis kuantitatif dengan spektrofotometer sinar tampak dengan mengukur
absorbansinya kemudian kadar Rhodamin B dalam sampel dapat dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y = ax + b.
Spektrofotometri Sinar Tampak adalah pengukuran absorbansi energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada suatu panjang gelombang tertentu Day,
2002. Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang struktur yang bias didapatkan dari spektrum ini. Tetapi
Universitas Sumatera Utara
spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer Darchriyanus, 2004; Rohman, 2007. Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara
200-400 nm, dan sinar tampak mempunyai panjang gelombang 400-750 nm Darchriyanus, 2004; Ditjen POM, 1995.
Hukum Lambert-Beer Beer’s Law adalah hubungan linieritas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit Darchriyanus, 2004. Menurut
Rohman 2007 dan Day 2002, Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal
dan konsentrasi larutan dan berbanding terbalik dengan transmitan. Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalan
panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu
larutan baku pada konsentrasi tertentu. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal,
yaitu : 1.
Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap
satuan konsentrasi adalah yang paling besar. 2.
Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi.
Universitas Sumatera Utara
3. Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh
pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal.
Ada beberapa tahapan yang harus dilakukan dalam analisis dengan spektrofotometri ultraviolet dan cahaya tampak yaitu:
1. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang dimana terjadi absorbansi maksimum. Untuk memperoleh panjang
gelombang maksimum dapat diperoleh dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku dengan konsentrasi
tertentu. 2.
Waktu kerja operating time Tujuannya ialah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu
kerja ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan.
3. Pembuatan Kurva Kalibrasi
Dilakukan dengan membuat seri larutan baku dalam berbagai konsentrasi kemudian absorbansi tiap konsentrasi diukur lalu dibuat kurva yang merupakan
hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Kurva kalibrasi yang lurus menandakan bahwa hukum Lambert-Beer terpenuhi.
4. Pembacaan absorbansi sampel
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya terletak antara 0,2 sampai 0,8 atau 15 sampai 70 jika dibaca sebagai transmitan. Hal ini
Universitas Sumatera Utara
disebabkan karena kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal.
5. Perhitungan Kadar Perhitungan kadar dapat dilakukan dengan metode regresi yaitu dengan
menggunakan persamaan garis regresi yang didasarkan pada harga serapan dan larutan standar yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit
menggunakan 5 rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan linier, kemudian di plot menghasilkan suatu kurva kalibrasi, konsentrasi
suatu sampel dapat dihitung berdasarkan kurva tersebut Rohman, 2007. Rumus perhitungan kadar rhodamin B:
Bs Fp
V X
K .
. =
Keterangan K = Kadar total rhodamin B dalam sampel mcgg
X = Kadar rhodamin B sesudah pengenceran
V = Volume sampel ml
Fp = Faktor pengenceran Bs = Berat sampel
2.5 Perolehan Kembali Persen perolehan kembali digunakan untuk menyatakan kecermatan.