BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian deskriptif yaitu untuk memeriksa zat pewarna Rhodamin B dan untuk mengetahui kadar Rhodamin B
dalam saus dan kerupuk. Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi
Kualitatif Fakultas Farmasi USU. 3.1 Alat-Alat
Alat-alat yang digunakan terdiri dari spektrofotometer UV Mini-1240 Shimadzu yang dihubungkan dengan printer Epson LQ 300, neraca analitis
Vibra, bejana, lampu UV 254 nm, benang wool, plat KLT, pipet totol, kertas saring, pro pipet, penangas air dan alat-alat gelas seperti labu tentukur, pipet
volume, gelas ukur, beaker glass, erlenmeyer, corong, cawan penguap dan batang pengaduk.
3.2 Bahan-Bahan
Bahan pereaksi yang digunakan adalah HCl 0,1 N, Larutan Amonia 2, NaOH 10, NaOH 0,5, Aquades, Eter, Asam asetat 6, Larutan Amonia 10,
Butanol dan Asam asetat glacial. Pembuatan HCl 0,1N yaitu dengan mengencerkan 8,3ml asam klorida pekat 37
v
v
dengan air suling dalam labu tentukur 1000 ml Ditjen POM, 1979. Pembuatan NaOH 10 dengan
melarutkan 10 gram natrium hidroksida dalam 100 ml air suling bebas CO
2.
Pembuatan NaOH 0,5 dengan melarutkan 5 gram natrium hidroksida dalam 1000 ml air suling bebas CO
2
Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Metode Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu didasarkan pada produk yang beredar dipasaran baik yang bermerek dan yang tidak bermerek.
Pengambilan sampel didasarkan atas pertimbangan bahwa sampel yang diambil dapat mewakili seluruh populasi sampel yang beredar di kota Medan dan sampel
yang dianalisis dianggap sebagai sampel yang representatif Sudjana, 1996. Sampel yang diperiksa adalah saus cabai dan tomat dan kerupuk. Sampel
saus cabai yang bermerek 9 botol dan yang tidak bermerek 5 botol dan saus tomat yang bermerek 7 botol dan yang tidak bermerek 8 botol. Kerupuk
bermerek 4 macam dan kerupuk tidak bermerek 6 macam.
3.4 Prosedur Kerja 3.4.1 Pemeriksaan Kualitatif Rhodamin B
Pemeriksaan Kualitatif Rhodamin B pada sampel menggunakan metode Spektrofotometer Sinar Tampak dan Kromatografi Lapis Tipis KLT.
3.4.1.1 Metode Spektofotometer Sinar Tampak
Metode Spektofotometer Sinar Tampak berdasarkan prosedur dari BPOM, 2006. Prinsip dari metode ini adalah dengan membandingkan kurva absorbansi
yang diukur dengan spektofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 450- 750nm.
Pembuatan Larutan Baku Pembanding dan Larutan Uji
Larutan baku pembanding dibuat dengan cara melarutkan baku pembanding Rhodamin B dengan HCl 0,1N Larutan A dan larutan uji dibuat
dengan menimbang sejumlah ± 15-20 gram sampel yang telah dihomogenkan, ditimbang seksama dan dimasukkan kedalam erlenmeyer 250 ml, ditambah
Universitas Sumatera Utara
dengan 100 ml larutan amonia 2 dan didiamkan semalam sehingga semua pewarna larut. Larutan disaring dan diuapkan diatas penangas air hingga kering.
Pewarna dilarutkan secara kuantitatif dengan 30 ml, dimasukkan kedalam corong pisah 250 ml, ditambahkan 6 ml larutan natrium hidroksida 10. Lalu diekstraksi
dengan 30 ml dietil eter. Ekstrak eter dipisahkan dan dicuci dengan larutan natrium hidroksida 0,5. Ekstrak eter diekstraksi tiga kali, tiap kalinya dengan 10
ml asam klorida 0,1N hingga lapisan eter tidak berwarna lagi, lapisan dibuang, ekstrak asam klorida 0,1N ditampung dalam labu tentukur 50 ml dan ditambahkan
asan klorida 0,1 N sampai tanda Larutan B. Masing-masing larutan A dan B diukur secara spektofotometer UV-Visibel pada panjang gelombang 450nm-
750nm.
3.4.1.2 Metode Kromatografi Lapis Tipis
Metode Kromatografi Lapis Tipis KLT berdasarkan prosedur dari BPOM, 2000. Prinsip dari metode KLT adalah dengan membandingkan harga Rf
dan bila dilihat secara visual berwarna merah jambu dan dibawah sinar UV 254nm berfluoresensi kuning. Dari prosedur ini terlebih dahulu dibuat larutan
sampel, larutan sampel yang ditambah dengan baku pembanding dan larutan baku pembanding kemudian di identifikasi dengan kromatografi lapis tipis.
1. Larutan Sampel
a. Timbang sampel masing-masing 30 gram larutkansuspensikan masing-
masing sampel dalam 50 ml aquades kemudian tambahkan asam asetat 6 , masukkan benang wool dan panaskan diatas penangas sambil diaduk-
aduk sampai warna terserap.
Universitas Sumatera Utara
b. Jika larutan masih berwarna dapat ditambahkan lagi benang wool sambil
dipanasi sampai semua warnanya terserap dan larutan menjadi tidak berwarna. Benang wool yang berwarna cuci berulang-ulang dengan
aquades hingga bersih. c.
Benang wool yang telah bersih dimasukkan ke dalam cawan penguap, tambahkan larutan ammonia 10 secukupnya, dipanaskan diatas
penangas air hingga warna benang wool luntur. d.
Larutan berwarna yang dperoleh dikumpulkan dalam cawan porselin dan diuapkan diatas penangas air hingga kering dan dilarutkan dalam 2ml air.
2. Larutan Sampel yang ditambah Baku Pembanding
a. Timbang sampel masing-masing 30 gram larutkan masing-masing sampel
dalam 50 ml aquades dan tambahkan 50 mg Rhodamin B pada masing- masing sampel,
b. Kemudian dibuat perlakuan yang sama dengan larutan sampel.
3. Larutan Baku Pembanding
Dibuat dengan cara menimbang 50 mg Rhodamin B kemudian dilarutkan dalam 100 ml aquades.
4. Identifikasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
a. Sediakan Plat Pra Lapis GF 254
b. Penjenuhan Chamber
Chamber dilapisi dengan kertas saring lalu tuang eluen butanol : asam asetat glasial : aquades dengan perbandingan 40 : 10: 24 kemudian tutup
rapat dan dibiarkan sampai jenuh yang ditandai dengan eluen naik sampai bagian atas kertas saring.
Universitas Sumatera Utara
c. Penotolan
1. Larutan sampel ditotolkan pada garis penotolan plat yang berjarak 2
cm dari tepi plat menggunakan pipet kapiler yang telah dibilas dengan aquades, penotolan dilakukan dengan tegak lurus.
2. Larutan sampel yang ditambah dengan baku pembanding ditotolkan
pada garis penotolan yang berjarak 2 cm dari titik penotolan sampel menggunakan pipet kapiler yang telah dibilas dengan aquades,
penotolan dilakukan dengan tegak lurus. 3.
Larutan baku pembanding ditotolkan pada garis penotolan yang berjarak 2 cm dari titik penotolan sampel dengan menggunakan pipet
kapiler yang telah dibilas dengan aquades, penotolan dilakukan dengan tegak lurus.
d. Proses Perambatan
Plat pra lapis yang telah ditotolkan dengan sampel dimasukkan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan eluen, kemudian chamber ditutup dan
dibiarkan beberapa saat sampai eluen naik sampai batas atas plat pra lapis. Angkat plat pra lapis kemudian keringkan dengan alat pengering.
e. Identifikasi Bercak
Letakkan plat pra lapis dibawah lampu UV dengan panjang gelombang 254nm, tandai bercak.
f. Menghitung Harga Rf
Dari bercak yang diperoleh dapat dihitung harga Rf.
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Penetapan Kadar Rhodamin B
Penetapan Kadar Rhodamin B pada sampel menggunakan prosedur dari BPOM, 2006. Prosedur ini dimulai dengan pembuatan larutan baku rhodamin B,
penentuan panjang gelombang, penentuan waktu kerja, kurva kalibrasi larutan rhodamin B dan penetapan kadar Rhodamin B pada sampel.
3.4.2.1 Pembuatan Larutan Baku Rhodamin B 3.4.2.1.1 Pembuatan Larutan Induk Baku I
Ditimbang dengan seksama 50 mg BPFI Rhodamin B kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml, larutkan dengan HCl hingga larut
kemudian diencerkan dengan HCl sampai garis tanda. Konsentrasi larutan induk baku I =
ml mg
50 50
x 1000mcgml = 1000mcgml
3.4.2.1.2 Pembuatan Larutan Induk Baku II
Dipipet 2,5 ml larutan induk baku I dengan menggunakan pipet volum, dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml kemudian diencerkan dengan HCl sampai
garis tanda. Konsentrasi larutan induk baku I =
ml ml
50 5
, 2
x 1000mcgml = 50mcgml
3.4.2.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Dipipet 2 ml dari larutan induk baku II Rhodamin B dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml kemudian diencerkan dengan HCl sampai garis tanda kadar
2mcgml, ukur serapan pada panjang gelombang 450-750nm, sebagai blanko digunakan HCl 0,1N.
Universitas Sumatera Utara
3.4.2.3 Penentuan Waktu Kerja
Dipipet 2,5 ml larutan induk baku II dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml konsentrasi 2,5 ppm, kemudian diencerkan dengan HCl sampai garis
tanda. Diukur pada panjang gelombang maksimum dan akan diperoleh absorban selama 30 menit, sebagai blanko digunakan HCl 0,1N.
3.4.2.4 Kurva Kalibrasi Larutan Rhodamin B
Dari larutan induk baku II dipipet sebanyak 1ml, 1,5ml, 2ml, 2,5ml dan 3 ml. Masing-masing dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml kemudian diencerkan
dengan HCl 0,1N sampai garis tanda. Sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1mcgml, 1,5mcgml, 2mcgml, 2,5mcgml dan 3mcgml. Kemudian
diukur serapannya pada panjang gelombang 557nm dan sebagai blanko digunakan HCl 0,1N akan diperoleh kurva konsentrasi vs absorban.
3.4.2.5 Penetapan Kadar Rhodamin B pada Sampel
Diisolasi Rhodamin B dari sampel, prosedur kerjanya sama dengan
pembuatan larutan sampel dilihat pada 2.4.1.2. Rhodamin B yang telah diisolasi
dari sampel disaring dan 10-20 filtrat pertama dibuang, filtrat selanjutnya ditampung dan diukur serapannya pada panjang gelombang 557nm dan sebagai
blanko digunakan HCl 0,1 N. Kadar Rhodamin B dalam sampel dapat dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi dengan persamaan regresi y = ax + b.
Rumus Perhitungan Kadar Rhodamin B.
Bs Fp
V X
K .
. =
Keterangan K = Kadar total rhodamin B dalam sampel mcgg
X = Kadar rhodamin B sesudah pengenceran V = Volume sampel ml
Fp = Faktor pengenceran Bs = Berat sampel
Universitas Sumatera Utara
3.5 Uji Validasi Metode Analisis
Validasi dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis.
Uji validasi yang digunakan yaitu uji akurasi dengan parameter uji perolehan kembali, batas deteksi dan batas kuantitatif.
3.5.1 Penentuan Uji Perolehan Kembali
Uji perolehan kembali dilakukan dengan menambahkan larutan baku Rhodamin B dengan konsentrasi 50 ppm sebanyak 1 ml kedalam sampel
kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama pada sampel. Menurut WHO 1992, perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus
sebagai berikut : Uji perolehan kembali =
A C
CA CF
−
x 100 Keterangan :
C
F
= Konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan larutan baku.
C
A
= Konsentrasi sampel sebelum penambahan larutan baku.
C
A
= Konsentrasi larutan baku yang ditambahkan.
3.5.2 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitatif
Batas Deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi. Batas Deteksi dapat diperoleh dari kalibrasi standar yang diukur
sebanyak 6 sampai 10 kali Gandjar, 2007;Satiadarma, 2004. Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Batas Deteksi = slope
SD x
3
Universitas Sumatera Utara
Batas Kuantitatif adalah kuantitatif terkecil analit dalam sampel yang masih dapat diukur dalam kondisi percobaan yang sama dan masih memenuhi
criteria cermat dan seksama WHO,1992. Batas kuantitatif dapat dihitung dengan rumus :
Batas Kuantitatif = slope
SD x
10
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pemeriksaan Kualitatif Rhodamin B pada Sampel
Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan kualitatif dan kuantitatif Rhodamin B pada sampel. Sebelum dilakukan pemeriksaan secara kuantitatif
maka perlu dilakukan pemeriksaaan secara kualitatif untuk mengetahui ada tidaknya rhodamin B pada sampel. Pemeriksaan kualitatif rhodamin B pada
sampel menggunakan metode Spektrofotometer Sinar Tampak dan Kromatografi Lapis Tipis KLT. Berdasarkan hasil pemeriksaan kualitatif rhodamin B dengan
menggunakan spektrofotometer sinar tampak maka diperoleh kurva absorbansi seperti pada Gambar 2.
Identifikasi spektrofotometer sinar tampak yaitu dengan membandingkan kurva absorbansi pada panjang gelombang 450-750nm Kenkel, 1994. Dari
gambar 2 dapat dilihat bahwa sampel mempunyai kurva absorbansi yang sama dengan kurva absorbansi baku pembanding rhodamin B maka dapat disimpulkan
bahwa sampel positif mengandung rhodamin B. Kurva absorbansi larutan baku pembanding dengan sampel kerupuk yang mengandung Rhodamin B dapat dilihat
pada Gambar 2 Lampiran 2,3 dan 4, Halaman 38-40.
Universitas Sumatera Utara
Kategori