11 70:30, dan pada kacang polong ungu pelarut yang digunakan adalah 15
aseton Teeling et al., 1971; Galindo et al.,1999; Terahara et al., 2000; Awika et al
., 2004. Antosianin, seperti flavonoid lainnya, merupakan struktur dengan cincin
aromatik yang berisi substituen komponen polar dan residu glikosil sehingga menghasilkan molekul polar. Dengan keadaannya yang polar, antosianin lebih
mudah larut dalam air dibanding dalam pelarut non polar. Tergantung dari kondisi medianya, antosianin juga dapat larut dalam eter dengan pH dimana
molekul dapat terionisasi. Degradasi pigmen antosianin ini dapat diminimalisasi dengan membekukannya, freeze dried, atau spray dried
Jackman dan Smith, 1996.
D. PURIFIKASI ANTOSIANIN
Purifikasi dari ekstrak antosianin ini diperlukan karena tidak ada sistem pelarut yang dapat digunakan untuk memisahkan antosianin secara spesifik.
Sejumlah bahan-bahan lainnya yang harus dipertimbangkan antara lain adalah polifenol yang lain dan pektin yang dapat mengganggu stabilitas dan atau
analisis dari pigmen tersebut Jackman dan Smith, 1996. Menurut Timberlake dan Bridle 1997, pemurnian dari ekstrak
antosianin ini dapat menggunakan kromatografi kolom penukar ion dengan resin penukar kation Amberlite CG-50 atau Dowex 50 WX-4. Konsentrat
pekat dimasukkan ke dalam kolom sehingga antosianin akan diabsorpsi oleh resin sedangkan kotoran akan dielusi oleh air. Antosianin yang telah
diabsorpsi kemudian dielusi dengan metanol-HCl. Cara-cara lain yang dapat digunakan untuk memisahkan atau
memurnikan antosianin dari ekstrak kotor atau konsentratnya antara lain dengan menggunakan Sephadex G-25 atau LH-20, Droplet counter-current
chromatography DCCC dengan menggunkan n-butanol-asam asetat glasial-
air sebagai sistem pelarut, preparative thin layer chromatography PTLC Jackman dan Smith, 1996.
Secara tradisional, pemurnian antosianin untuk tujuan analisis ini dilakukan dengan kromatografi kertas atau kromatografi lapis tipis TLC.
Bagaimanapun juga cara yang lebih efektif dan lebih cepat untuk memisahkan
12 campuran yang komplek adalah dengan menggunakan reversed-fase High
Performance Liquid Chromatography HPLC. Teknik ini tidak merusak
komponen dan menghasilkan pemisahan komponen yang dapat dibaca untuk analisis berikutnya Jackman dan Smith, 1996.
Salah satu metode pemurnian antosianin yang dilakukan pada sampel kulit buah leci Litchi chinensis Sonn. adalah dengan menggunakan Sephadex
G-25 cartridge dan dielusi dengan 50 aseton1 asam format air Lee dan Wicker, 1991. Pemurnian antosianin pada pinta boca Solanum stenotomom
dilakukan dengan menggunakan solid phase extraction SPE didalam C-18 cartridges
Eon et al., 2004.
E. KARAKTERISASI ANTOSIANIN
Metode kromatografi dan spektroskopik telah digunakan untuk mengidentifikasi antosianin secara cepat dan akurat. Akan tetapi, karakteristik
mutlak dari antosianin tidak dapat ditentukan hanya dengan menggunakan kromatografi atau spektroskopi saja. Karakteristik struktural dari antosianin ini
biasanya melibatkan identifikasi dari aglikon, gula dan gugus asil Jackman dan Smith, 1996. Menurut Markakis 1982, aglikon dan bagian dari gula ini
dapat diidentifikasi dengan hidrolisis asam yang diikuti dengan kromatografi kertas.
Menurut Jackman dan Smith 1996, karakterisasi dari antosianin ini melibatkan hidrolisis asam, basa, enzim, dan peroksida. Hidrolisis asam
digunakan untuk memecah aglikon dan gula dari pigmen tersebut, sedangkan hidrolisis basa ini digunakan untuk menentukan aglikon alami dan untuk
menentukan gugus asil. Selain itu, penentuan karakterisasi dari pigmen antosianin ini juga dapat dilakukan dengan analisis spektroskopi. Menurut
Markham 1988, analisis spektroskopi UV dan sinar tampak merupakan cara tunggal yang paling berguna untuk menganalisa struktur flavonoid. Hal ini
dikarenakan ciri spektrum yang sama memberikan data mengenai jenis senyawa yang sama Harborne, 1987. Keuntungan dari cara spektroskopi ini
adalah sangat sedikitnya jumlah sampel yang diperlukan untuk analisis lengkap.
13 Prisip dasar dari analisis spektroskopi adalah bila suatu sinar melalui
larutan kimia tertentu, maka senyawa tersebut akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu. Warna larutan kimia tergantung pada jenis sinar
yang dipancarkan dan tertangkap oleh mata kita, sehingga senyawa kimia ada yang berwarna ataupun tidak berwarna. Spektrofotometer merupakan alat
pengukur kualitatif dan kuantitatif karena jumlah sinar yang diserap oleh partikel di dalam larutan juga tergantung pada jenis dan jumlah partikel. Ada
beberapa jenis spektroskopi, salah satunya adalah spektroskopi absorpsi Nur, 1989.
Spektroskopi absorpsi memiliki prinsip dasar yaitu bila suatu cahaya putih atau radiasi dilewatkan melalui larutan berwarna, maka radiasi dengan
panjang gelombang tertentu akan diserap absorpsi secara selektif dan radiasi lainnya akan diteruskan transmisi. Absorpsi maksimum dari larutan
berwarna terjadi pada daerah berlawanan. Misalnya larutan merah akan menyerap radiasi maksimum pada daerah warna hijau. Dengan kata lain,
warna yang diserap adalah warna komplementer dari warna yang diamati. Sehingga larutan yang berwarna merah akan menyerap radiasi panjang
gelombang sekitar 500 nm Nur, 1989. Kromatografi adalah salah satu teknik yang dapat digunakan untuk
memisahkan dan mengidentifikasikan komponen-komponen yang tersebar pada tanaman tingkat tinggi. Teknik-teknik kromatografi sederhana seperti
kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, dan kromatografi kolom terbuka dapat digunakan untuk mengisolasi dan menganalisis antosianin Strack dan
Wray, 1993. Analisis dengan kromatografi lapis tipis TLC ini sudah diaplikasikan untuk menganalisis bermacam-macam komponen meliputi
lemak, karbohidrat, vitamin, asam amino, dan pigmen alami. Salah satu analisis pigmen antosainin yang menggunakan TLC dilakukan pada kulit buah
anggur Fong et al., 1971; Heidari et al., 2004. Karakterisasi pigmen hasil kromatografi kemudian dibandingkan
dengan standar antosianin, aglikon, dan gula. Meskipun antosianin dan aglikon dapat diperoleh dari berbagai sumber, antosianin ini memerlukan
pemurnian sebelum penggunaannya sebagai pigmen standar. Sebagai pemasti
14 akhir, pembandingan langsung dengan senyawa autentik harus dilakukan. Bila
senyawa autentik tidak terdapat, maka perbandingan yang seksama dengan data pustaka sudah mencukupi untuk identifikasi Harborne, 1987.
III. METODOLOGI PENELITIAN
