32 kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan disimpan dalam freezer.
Penyimpanan dalam freezer ini bertujuan untuk menjaga stabilitas antosianin yang sangat mudah terdegradasi.
C. PURIFIKASI ANTOSIANIN
Purifikasi adalah suatu cara untuk mendapatkan pigmen yang murni. Menurut Francis 1982, purifikasi perlu dilakukan karena pada umumnya
pigmen yang berasal dari ekstrak tanaman biasanya mengandung pigmen flavonoid yang lain, leukoantosianin, gula, dan senyawa-senyawa lainnya
yang dapat mengganggu pemisahan. Sistem purifikasi yang ideal untuk campuran antosianin dapat menghilangkan komponen-komponen yang
mengganggu. Menurut Timberlake dan Bridle 1983, purifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi dan kertas kromatografi.
Pada umumnya dalam analisis kromatografi pemisahan komponen kimia pada sampel melibatkan fase padat dan cair.
Purifikasi pada penelitian ini menggunakan metode yang disebut solid phase extraction
SPE. SPE adalah teknik persiapan yang digunakan untuk membersihkan sampel. Pada prinsipnya SPE digunakan karena bahan yang
mendukung berupa padatan yang dilalui oleh cairan atau gas. Banyak keuntungan yang didapat dari penggunaan SPE ini. Beberapa keuntungannya
adalah ukuran sampelnya dapat besar atau kecil, volume yang diperlukan untuk mengelusi sedikit, dan kemungkinan sampel untuk terkontaminasi
sangatlah kecil karena kolom hanya digunakan sekali saja dan kemudian dibuang Anonim, 1998. Penggunaan SPE ini dilakukan karena persiapan
sampel yang baik sangat penting untuk menghasilkan analisis yang baik pula. Purifikasi dalam penelitian ini dilakukan pada sampel ekstrak kasar.
Kolom yang digunakan untuk pemurnian antosianin pada penelitian ini adalah C-18 Sep Pak Cartridge. Fase padat terdapat dalam kolom adalah C-18,
sedangkan cairan atau fase gerak terdiri dari sampel itu sendiri atau larutan alkohol. C-18 Sep Pak Cartridge terbuat dari reaksi oktadesil dengan silika.
Komponen non polar dari sampel akan ditarik oleh rantai panjang hidrokarbon sedangkan komponen yang polar akan ditarik oleh matrik silika yang sedikit
polar Anonim, 2007b.
33 Purifikasi antosinin dalam penelitian ini diawali dengan mengaktifkan
kolom C-18 Sep Pak cartridge dengan larutan metanol dan air telah diasamkan dengan 0.01 HCl. Menurut Anonim, 2007b, cartridge yang
akan digunakan pertama kali harus dibasahi atau dilalui dengan suatu pelarut yang polar seperti metanol. Setelah itu dielusi dengan menggunakan air untuk
menghilangkan sisa-sisa metanol yang tertinggal. Kolom yang telah diaktifkan kemudian dapat digunakan. Sampel
ekstrak kasar dimasukkan dalam kolom. Komponen-komponen yang polar akan terikat, sedangkan yang non-polar tidak. Kolom tersebut kemudian
dielusi dengan menggunakan air yang diasamkan dengan 0.01 HCl. Hal ini mengakibatkan komponen seperti gula, asam, dan komponen pengganggu
lainnya akan terelusi dan hanya tersisa pigmen antosianin dan komponen fenolik lainnya. Menurut Anonim, 2007b, komponen polar seperti gula,
asam, dan flavor akan terelusi dengan melewatkan air kedalam cartridge. Menurut Timberlake dan Bridle 1983, ekstrak kasar dimasukkan pada bagian
atas kolom, antosianin yang terdapat dalam sampel akan terabsorbsi dan senyawa-senyawa pengganggu dibersihkan dengan melewatkan air. Pigmen
antosianin akan terpisahkan dan dielusi dengan menggunakan alkohol. Dalam penelitian ini pigmen antosianin kemudian dielusi dengan menggunakan
metanol yang mengandung 0.01 HCl. Pelarut yang selektif dapat mengalahkan daya tarik antara komponen dengan cartridge sehingga
komponen yang terikat pada cartridge tersebut dapat terlarut. Penggunaan HCl dalam konsentrasi yang sedikit saat pengelusian antosianin sangat cocok
dengan stabilitas antosianin Timberlake dan Bridle, 1983. Larutan yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan
rotary vacuum evaporator dengan suhu 35
o
C sehingga didapatkan pigmen murni yang pekat. Pigmen pekat ini kemudian dilarutkan dalam air deionisasi
yang mengandung 0.01 HCl. Hasil yang diperoleh kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan disimpan sehingga dapat digunakan untuk tahapan
berikutnya. Penyimpanan ini dilakukan dalam freezer untuk mengurangi degradasi pigmen antosianin yang telah murni ini. Hal ini disebabkan sifat
antosianin yang tidak stabil terhadap suhu dan cahaya Jackman dan Smith,
34 1996. Menurut Francis 1982, tujuan akhir dari purifikasi adalah untuk
mendapatkan konsentrasi pigmen antosianin yang sudah tidak mengandung gula dan komponen yang dapat mendegradasi pigmen tersebut dengan tidak
mengubah komposisi antosianin pada sampel.
D. KARAKTERISASI ANTOSIANIN
