III. BAHAN DAN METODE
3.1 Produksi Hormon Pertumbuhan Rekombinan
Produksi hormon pertumbuhan rekombinan dilakukan sesuai dengan metode Alimuddin et al. 2010. Satu koloni bakteri Escherichia coli dipilih dari
media 2xYT padat untuk diinokulasi ke dalam 5 mL media LB yang mengandung 1 ampisilin dan ditumbuhkan semalam pada suhu 37
o
C sambil dikocok lembut menggunakan shaker. Selanjutnya, sebanyak 5 µL kultur ini disubkultur di dalam
5 mL media LB yang mengandung 100 µL ampisilin pada suhu media 37
o
C sambil dikocok lembut dengan shaker. Setelah dua jam kultur E. coli diberi cold
shock pada suhu 15
o
C selama 30 menit. Ekspresi rekombinan HPr kemudian diinduksi pada kondisi OD
600
dengan isopropyl-b-D-thiogalac-topyranoside IPTG dengan dosis 800 µL dan selanjutnya ditumbuhkan pada suhu 15
o
C selama 24 jam. Sel bakteri kemudian dipanen dengan sentrifugasi pada 4000 rpm
selama 5 menit, kemudian disimpan pada suhu -80
o
Lisis dinding sel bakteri dilakukan secara kimiawi dengan menggunakan lisozim. Pelet bakteri hasil sentifugasi dicuci menggunakan 1 mL TE buffer
per 200 mg bakteri dan diinkubasi pada suhu 37 C hingga akan digunakan.
Proses selanjutnya dilakukan lisis dinding sel bakteri dan analisis protein HPr menggunakan teknik SDS-PAGE.
o
C selama 20 menit, disentrifugasi pada 12.000 rpm 4
o
C selama 1 menit dan kemudian supernatant dalam tabung mikro dibuang. Pelet bakteri sebanyak 200 mg dalam tabung mikro ditambahkan
500 µL larutan lisozim 10 mg dalam 1 mL buffer TE, diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang, dan pelet yang terbentuk merupakan protein HPr dalam
bentuk badan inklusi inclusion body. Pelet HPr dicuci dengan PBS sebanyak 1 kali dan disimpan pada suhu -80
Analisis protein HPr dilakukan menggunakan teknik SDS-PAGE berdasarkan metode
Blackshear 1984 dalam Bollag et al. 1996. Gel yang dibuat dalam SDS-PAGE terdapat 2 lapisan gel dalam proses SDS-PAGE yaitu
running gel dan stacking gel 12 mengandung 4,62 mL H C hingga digunakan.
2
O; 5,60 ml acrilamideBis 29:1; 3,5 mL Gel Buffer 1,5 M pH 8,8; 140 µL SDS 10; 140
11 µL APS 10; dan 5,6 µL TEMED, stacking gel 5 mengandung 3,4 mL H
2
O; 0,83 mL acrilamideBis 29:1; 0,63 ml gel buffer 1,5 M pH 6,8; 50 µl SDS 10;
50 µL APS 10 dan 50 µL TEMED. Protein HPr sebanyak 1 mg ditambahkan 10 µL PBS dan 10 µL loading buffer, kemudian diinkubasi pada suhu 100
C selama 10 menit. Loading buffer mengandung 1,5 M tris-HCl pH 6,8, 2 M
Dithiothreitol, SDS 10. Bromophenol blue, gliserol 87, dan ddH
2
O, coomassie brilliant blue R-250 dan asam asetat glasial selama 3 jam. Gel
dimasukkan ke dalam de-staining solution etanol, ddH
2
3.2 Percobaan Pertama
Kategori