13 ekor larva umur 2 hari setelah menetas, direndam selama 2 menit dalam air
volume 1 liter bersalinitas 30 ppt, dan selanjutnya direndam selama 1 jam dalam air mengandung BSA 0,01 dan NaCl 0,9. Ikan diberi pakan berupa naupli
Artemia segar selama 7 hari, dilanjutkan dengan cacing sutera sampai berumur 30 hari Setelah berumur 4 minggu ikan dipindahkan ke kolam dan dipelihara hingga
berumur 12 minggu dan diberi pakan buatan.
3.4 Analisis Ekspresi Gen IGF-I
3.4.1 Isolasi RNA Total
Sampel ikan gurami dikumpulkan 24 jam setelah perlakuan perendaman hormon pertumbuhan rekombinan dari ikan gurami. Sebagai kontrol dikumpulkan
sampel ikan tanpa perlakuan perendaman HPr, dan sampel ikan setelah kejutan salinitas. Total RNA jaringan tubuh diekstraksi menggunakan isogen Nippon
Gen, Japan sesuai prosedur dalam manual. Jaringan dimasukkan ke dalam tabung berisi isogen 200 µL, dihancurkan menggunakan penggerus yang sebelumnya
telah disterilkan dengan DEPC 1. Ke dalam tabung ditambahkan larutan isogen sampai mencapai volume akhir 400 µL. Sebanyak 200 µL kloroform
ditambahkan ke dalam tabung, dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke
dalam tabung baru yang telah berisi 400 µL isopropanol. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4
o
C. Supernatan dibuang, kemudian RNA difiksasi dengan 1 mL etanol 70, disentrifugasi dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4
o
3.4.2 Sintesis cDNA
C. RNA dikeringkan dengan cara membuang larutan yang terdapat pada tabung. RNA dilarutkan dengan cara
menambahkan 30 µL DEPC 1. Konsentrasi RNA total hasil isolasi diukur menggunakan alat pengukur konsentrasi RNADNA GenQuant. Absorbansi
diukur pada panjang gelombang 260, dan 280 nm.
Sintesis cDNA IGF-I ikan gurami dilakukan menggunakan kit Ready-To- Go You-Prime First Strand Beads Amersham Pharmacia Biotech, USA. RNA
sebanyak 3 µg dalam 30 µL DEPC, diinkubasi pada suhu 65
o
C selama 10 menit,
14 kemudian didinginkan di atas es. Larutan RNA dipindahkan ke dalam tabung
berisi kit sintesis cDNA, dan ditambahkan 1 µg primer dT3’RACE-VECT 5’-GTAATACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTT
TTTTTTTTTTTTTTTTT-’. Larutan dihomogenkan, dan diinkubasi pada suhu 37
o
3.4.3 PCR dan Kuantifikasi Ekspresi Gen IGF-I
C selama 1 jam. cDNA yang terbentuk ditambahkan 30 µL SDW steril, dan disimpan dalam refrigerator hingga akan digunakan.
Ekspresi gen IGF-I dideteksi dengan menggunakan teknik RT-PCR menggunakan primer F 5’-TTCAAGAGTGTCATGTGCTGTA-3’
dan R 5’-CATAGCCTGTTGGTTTACTGAA-3’ Irmawati, komunikasi pribadi.
Kontrol int
ernal menggunakan gen β-aktin. Gen β-aktin dilacak dengan
menggunakan metode RT-PCR dengan primer F 5’-AACCATGGATGATGAA ATCGCCGCA-3’ dan R 5’-TGATGCCTGGGGCGA-CCGACGATGG-3’
Irmawati, komunikasi pribadi. PCR gen IGF-I dilakukan dengan program: 94
o
C selama 1 menit; 94
o
C selama 30 detik; 57
o
C selama 30 detik; 72
o
C selama 30 detik sebanyak 35 siklus; 72
o
C selama 1 menit; dan 4
o
C tak hingga. PCR gen β-aktin dilakukan dengan program: 94
o
C selama 1 menit; 94
o
C selama 30 detik; 59
o
C selama 30 detik; 72
o
C selama 30 detik sebanyak 30 siklus; 72
o
C selama 1 menit; dan 4
o
3.5 Analisis Kadar Hormon Kortisol
