3.3. Metode Penelitian 3.3.1. Pengambilan Contoh Tanah
Pengambilan contoh tanah dilakukan secara komposit pada kedalaman 0-5cm di rhizosfer enam tanaman A. malaccensis yang telah menghasilkan gaharu.
Tanaman dipilih secara acak di lahan kebun campuran A. malaccensis dan pinang. u
Keterangan: = pohon penghasil gaharu
= lubang contoh bahan tanah = jarak ±1 m atau jarak disesuaikan
dengan besar pohon di lapang
Contoh tanah komposit diperoleh dengan cara mencangkul tanah pada kedalaman 0-5 cm dari 4 penjuru mata angin barat, timur, utara, dan selatan
dari masing-masing tanaman A. malaccensis sejauh ±1 m Gambar 2. Terdapat pengecualian pada contoh tanaman kedua karena tempat berdirinya pohon berada
dekat dengan tebing, sehingga contoh tanah hanya dapat diambil dari 3 penjuru mata angin yaitu barat dan timur masing-masing berjarak ±1 m serta selatan
berjarak 50 cm dari tanaman. Contoh tanah tidak terganggu diambil dengan menggunakan ring sampler volume 98,13 cm
3
tinggi dan diameter ring masing-masing 5 cm dari selain 4 penjuru mata angin utama yang minim
gangguan.
3.3.2. Analisis Biologi
Analisis biologi yang dilakukan pada penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jenis fungi dan bakteri yang dapat mendegradasi selulosa dan pektin
dengan indeks pelarutan paling tinggi yang diperoleh dari rhizosfer tanaman A. malaccensis. Berikut ini tahapan dalam proses analisis biologi:
a. Isolasi
Tahap awal yang dilakukan adalah melakukan isolasi mikrob yang berasal dari contoh tanah sehingga mikrob yang diinginkan dapat dipisahkan dan
ditumbuhkan dalam media tertentu sehingga dapat digunakan untuk keperluan uji lanjutan. Isolasi mikrob dimulai dengan pembuatan larutan tanah yaitu
Gambar 2. Denah pengambilan contoh tanah
memasukkan 10 gram tanah ke dalam 90 ml larutan fisiologis 0,85 NaCl yang dilanjutkan dengan membuat seri pengenceran yang bertujuan untuk mengurangi
populasi mikrob sehingga dihasilkan koloni murni atau tunggal. Pada pengenceran 10
-4
-10
-7
dilakukan pemipetan masing-masing sebanyak 1 ml yang dimasukkan ke dalam cawan petri dengan tiga kali ulangan untuk mengisolasi bakteri, sedangkan
pengenceran 10
-3
-10
-5
digunakan untuk mengisolasi fungi. Dengan menggunakan metode agar tuang atau agar cawan, media pertumbuhan mikrob yang telah
diautoklaf tersebut dituangkan ke masing-masing cawan petri sebanyak 10-15 ml. Media SEA digunakan untuk menumbuhkan dan mengisolasi bakteri tanah,
sedangkan media PDA dengan modifikasi penambahan antibiotik digunakan untuk menumbuhkan dan mengisolasi fungi. Proses inkubasi dilakukan pada suhu
ruang selama 3-7 hari. b.
Pemurnian Pemurnian purification bertujuan agar diperoleh biakan murni yang
diinginkan tanpa ada kontaminan dari mikrob lain. Pemilihan koloni mikrob yang dimurnikan berdasarkan perbedaan kenampakan morfologi koloni, baik dari segi
warna, elevasi, tekstur permukaan, garis-garis radial, lingkaran konsentris maupun tetes eksudat sehingga diperoleh isolat murni. Pemurnian isolat bakteri dilakukan
dengan cara memindahkan bakteri menggunakan metode garis yang kemudian ditumbuhkan pada media NA nutrient agar, sedangkan pada pemurnian isolat
fungi menggunakan metode titik dalam proses pemindahan ke dalam media PDA. c.
Pengujian isolat dalam mendegradasi selulosa dan pektin Isolat bakteri dan fungi yang diperoleh selanjutnya menjalani uji
kemampuan mendegradasi selulosa dan pektin. Masing-masing isolat ditumbuhkan pada media khusus yaitu CMC, CPAF berdasarkan penelitian
Molina et al. 2001, dan CPAB berdasarkan penelitian Soares et al. 1999 dengan beberapa modifikasi. Isolat-isolat yang ditumbuhkan dalam media selektif
tersebut diinkubasi pada suhu ruangan selama 3 hari. Di akhir masa inkubasi, koloni yang terbentuk dari masing-masing isolat digenangi larutan Congo Red
0,1 untuk isolat yang ditumbuhkan pada media CMC, sedangkan untuk koloni yang ditumbuhkan pada media CPAF dan CPAB digenangi dengan larutan
iodine-potassium iodide atau iodine Gram. Setelah minimal 15 menit proses
penggenangan berlangsung, larutan dikeluarkan dari cawan petri kemudian bilas permukaan koloni dengan aquadest. Bila terdapat zona bening di sekeliling koloni
isolat, maka isolat tersebut dapat mendegradasi selulosa atau pektin bergantung pada media tumbuh yang digunakan. Pengukuran diameter koloni dan diameter
zona bening dilakukan untuk mengetahui indeks pelarutan selulosa maupun pektin oleh koloni mikrob. Berikut ini rumus perhitungan indeks pelarutan:
Indeks pelarutan = diameter zona bening diameter koloni Contoh perhitungan:
Gambar 3 menunjukkan isolat fungi 7 yang ditumbuhkan pada media CPAF selama 3 hari
pada suhu ruangan. Setelah digenangi iodine Gram, dapat diketahui diameter koloni 13 mm
dan diameter zona bening 37 mm. Maka: Indeks pelarutan = 37 mm 13 mm
= 2,85 Gambar 3. Pengukuran komponen
indeks pelarutan d.
Identifikasi isolat Koloni mikrob yang menunjukkan kemampuan mendegradasi selulosa dan
pektin dengan indeks pelarutan tinggi selanjutnya menjalani proses identifikasi. Proses identifikasi untuk isolat fungi meliputi kenampakan morfologi dan
mikroskopiknya, sedangkan untuk isolat bakteri proses identifikasi berdasarkan Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology melalui hasil uji biokimia.
3.3.3. Analisis Kimia
