16 Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian
a. Penentuan aktivitas invertase
Aktivitas enzim diukur berdasarkan definisi satu unit aktivitas invertase, yaitu banyaknya invertase yang dapat membebaskan
1 mikromol gula pereduksi dari substrat sukrosa selama 1 menit pada kondisi percobaan. Kondisi yang digunakan adalah kondisi optimum
invertase, yaitu pada suhu 55°C, di dalam larutan buffer asetat pH 4.5. Slope
yang diperoleh dari gula pereduksi yang dihasilkan pada setiap
konsentrasi yang diujikan merupakan besarnya aktivitas enzim. b.
Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO
4
CuSO
4
dengan konsentrasi yang berbeda diujikan pada reaksi invertase dengan sukrosa. Nilai gula pereduksi yang lebih rendah dari
kontrol perlakuan invertase tanpa CuSO
4
menunjukkan adanya inhibisi, sebaliknya jika lebih tinggi dari kontrol menunjukkan aktivasi.
Pengaruh yang berbeda nyata diukur berdasarkan analisis sidik ragam ANOVA dan uji lanjut Duncan.
Mulai
Penentuan aktivitas invertase
Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO
4
Penentuan pengaruh perubahan faktor dengan adanya penambahan CuSO
4
terhadap degradasi sukrosa
Penentuan parameter kinetika K
M
dan V
maks
laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO
4
Selesai
17
c. Penentuan pengaruh hubungan faktor dengan adanya penambahan
CuSO
4
terhadap degradasi sukrosa
Uji karakterisasi invertase yang dilakukan antara lain pengaruh konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan
dengan ditambahkan CuSO
4
. Pengaruh yang diidentifikasi adalah adanya kenaikan atau penurunan konsentrasi gula pereduksi pada setiap
taraf yang diujikan berdasarkan analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan. Inhibisi invertase diukur berdasarkan perbandingan dengan
perlakuan tanpa CuSO
4
, dinyatakan dalam bentuk persen.
d. Penentuan parameter kinetika laju degradasi K
M
dan V
maks
sukrosa dengan adanya penambahan CuSO
4
Penentuan parameter kinetika dilakukan pada tiga suhu yang berbeda dan pH tertentu yang optimum bagi inhibisi invertase. Model
kinetika inhibisi diidentifikasi berdasarkan jenis perubahan nilai parameter kinetika K
M
dan V
maks
yang diperoleh dari plot Lineweaver- Burk. Nilai K
M
diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu x, sedangkan nilai V
maks
diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu y.
2. Prosedur Percobaan
