17
c. Penentuan pengaruh hubungan faktor dengan adanya penambahan
CuSO
4
terhadap degradasi sukrosa
Uji karakterisasi invertase yang dilakukan antara lain pengaruh konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu dan lama pemanasan
dengan ditambahkan CuSO
4
. Pengaruh yang diidentifikasi adalah adanya kenaikan atau penurunan konsentrasi gula pereduksi pada setiap
taraf yang diujikan berdasarkan analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan. Inhibisi invertase diukur berdasarkan perbandingan dengan
perlakuan tanpa CuSO
4
, dinyatakan dalam bentuk persen.
d. Penentuan parameter kinetika laju degradasi K
M
dan V
maks
sukrosa dengan adanya penambahan CuSO
4
Penentuan parameter kinetika dilakukan pada tiga suhu yang berbeda dan pH tertentu yang optimum bagi inhibisi invertase. Model
kinetika inhibisi diidentifikasi berdasarkan jenis perubahan nilai parameter kinetika K
M
dan V
maks
yang diperoleh dari plot Lineweaver- Burk. Nilai K
M
diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu x, sedangkan nilai V
maks
diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu y.
2. Prosedur Percobaan
Prosedur percobaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebagai berikut.
a. Penentuan aktivitas invertase
Larutan invertase 0.01 gl dan larutan sukrosa 50 gl disiapkan pada tabung reaksi yang terpisah. Masing-masing tabung reaksi
kemudian diinkubasi di dalam water bath suhu 55°C sehingga suhu tersebut dicapai oleh larutan di dalam tabung reaksi. Selanjutnya
sukrosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi invertase dan mulai diukur waktu reaksi t = 0. Reaksi dihentikan pada masing-masing
waktu yang diujikan, yaitu 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 detik, dengan memasukkan 2 ml pereaksi DNS. Kemudian tabung
tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95°C. Setelah
18 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
b. Penentuan konsentrasi inhibitor
Larutan CuSO
4
dibuat dalam beberapa konsentrasi, 0 mM- 3.75 mM. Masing-masing larutan CuSO
4
dalam berbagai konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan
sukrosa 50 gl sebanyak 0.5 ml dan divortex. Selanjutnya ditambahkan 1 ml invertase 0.01 gl pada masing-masing tabung reaksi t = 0. Pada
saat t = 5 menit, reaksi dihentikan dengan perekasi DNS. Prosedur untuk menghentikan reaksi mengikuti prosedur sebelumnya pada
penentuan aktivitas.
c. Penentuan pengaruh perubahan faktor
Penentuan pengaruh perubahan faktor dilakukan dengan maupun tanpa adanya penambahan inhibitor. Prosedur yang dilakukan
pada perlakuan tanpa inhibitor sama halnya dengan pengujian pada karakterisasi invertase dengan inhibitor, hanya tidak ditambahkan
larutan CuSO
4
. Total volume larutan dalam tiap tabung reaksi tetap sama yakni 2 ml, sehingga volume yang ditambah adalah aquades dan
buffer .
1. Pengaruh konsentrasi enzim
Larutan invertase 0.01 gl disiapkan pada berbagai konsentrasi sebanyak 0.0 - 0.83 ml dan ditambahkan larutan buffer
pH 7 hingga volumenya 1 ml. Kemudian ditambahkan larutan CuSO
4
2.5 mM sebanyak 0.1 ml pada masing-masing tabung reaksi. Selanjutnya larutan sukrosa 50 gl sebanyak 1 ml
dimasukkan pada tiap-tiap tabung tersebut, dan mulai dihitung waktunya t = 0 menit. Pada waktu t = 5 menit, dimasukkan 2 ml
pereaksi DNS untuk menghentikan reaksi. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95°C selama
10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang
540 nm.
19 2.
Pengaruh konsentrasi substrat Larutan CuSO
4
2.5 mM sebanyak 0.1 ml dimasukkan pada masing-masing tabung reaksi yang berisi larutan sukrosa 50 gl
dalam konsentrasi yang berbeda. Kemudian aquades ditambahkan hingga volume campuran mencapai 2.0 ml. Larutan invertase
0.01 gl sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke masing-masing tabung reaksi t = 0 menit. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti
prosedur sebelumnya. 3.
Pengaruh pH Invertase 0.01gl sebanyak 1.0 ml
dilarutkan dengan
menggunakan buffer pH yang bervariasi pH 3 - 11 pada tabung reaksi. Selanjutnya masing-masing tabung reaksi ditambahkan
larutan CuSO
4
2.5 mM sebanyak 0.1 ml dan 0.9 ml
larutan sukrosa 50 gl t = 0 menit. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti
prosedur sebelumnya. 4.
Pengaruh suhu Penangas air mulai suhu 0 - 90
o
C disiapkan dengan interval suhu 10
o
C. Pada setiap kelipatan suhu 10
o
C tersebut, diuji aktivitas invertase. Larutan CuSO
4
2.5 mM sebanyak 0.1 ml, 0.4 ml air dan larutan sukrosa 50 gl sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalam setiap
tabung untuk setiap kelipatan suhu 10
o
C. Tabung reaksi selanjutnya dimasukkan ke dalam penangas air pada rentang suhu
tersebut dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan invertase 0.01 gl sebanyak 1.0 ml ke dalam masing-masing tabung
reaksi t = 0 menit pada suhu inkubasi. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.
5. Pengaruh lama pemanasan
Larutan invertase 0.01 gl sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dan dipanaskan dengan waktu
yang bervariasi dari 0 - 5 menit. Setelah waktu yang diperlukan dicapai, tabung reaksi dikeluarkan dari water bath dan didinginkan.
20 Setelah itu larutan CuSO
4
2.5 mM sebanyak 0.1 ml dan larutan sukrosa 50 gl sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalamnya t =
0 menit. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya.
d. Penentuan parameter kinetika
Kategori