Disain Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian PERKIRAAN BESAR SAMPEL ANALISA DATA Kerangka operasional

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. Disain Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara analisa deskripsi dengan metode cross sectional study

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Departemen Patologi Klinik FK USU RSUP Dr H Adam Malik Medan bekerja sama dengan Departemen Penyakit Dalam FK USU RSUP H Adam Malik Medan. Penelitian dilakukan pada bulan September 2010 sampai November 2010

3.3. Populasi dan Subjek Penelitian

3.3.1. Populasi penelitian

Populasi penelitian adalah pasien-pasien yang berkunjung ke Poliklinik Penyakit Dalam dan Pasien yang dirawat di bangsal Bagian Penyakit Dalam RSUP. H. Adam Malik Medan dan kontrol orang sehat. Universitas Sumatera Utara

3.3.2. Subjek penelitian

Pasien dengan diagnosa anemia defisiensi besi menurut kriteria WHO yaitu laki-laki dewasa : hemoglobin 13 gdl, perempuan dewasa: hemoglobin 12 gdl dan nilai feritin 15ugL . Kemudian ditelusuri rekam medis untuk mencatat status pasien, seperti nama, umur, jenis kelamin, suku bangsa, alamat, pemeriksaan laboratorium lain, diagnosa dan terapi yang sudah diterima pasien. Subjek penelitian ini harus memenuhi kriteria berikut ini : Kriteria inklusi - Anemia defisiensi besi menurut WHO: - Anemia : i. laki-laki dewasa : hemoglobin 13 gdl ii. Perempuan dewasa: hemoglobin 12 ddl - Feritin 15 ugL - - Umur 18 tahun - Bersedia mengikuti penelitian persetujuan tertulis Kriteria Esklusi - Pasien yang baru menerima transfusi dalam 3 bulan terakhir - Tidak bersedia ikut dalam penelitian - Penserita thalassemia minor Universitas Sumatera Utara

3.4. PERKIRAAN BESAR SAMPEL

n = Z α + Z β Sd 2 d n = 1,96 – 1,282 0,5 2 0,25 n = 30 keterangan: N = jumlah sample Z α = nilai baku normal dari table Z yang besarnya tergantung pada nilai α yang ditentukan. Untuk α = 0,05 → Z α = 1,96. Z β = nilai baku normal dari table Z yang besarnya tergantung pada nilai β yang ditentukan . untuk β = 0,10 → Z β = 1,282 Sd = simpangan baku = 0,5 d = selisih rata-rata yang berulang = 0,25

3.5. ANALISA DATA

Analisa statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS versi 18. Analisa data dilakukan dengan perhitungan statistik. Untuk melihat perbedaan Kadar HbA2 pada penderita anemia defisiensi besi dibandingankan dengan kontrol digunakan uji T tes karena kedua kelompok yang diamati berdistrbusi Universitas Sumatera Utara normal. Sedangkan untuk melihat korelasi antar variabel digunakan korelasi Pearson. 3.6 BAHAN DAN CARA KERJA 3.6.1 Bahan dan pengolahan sampel Bahan penelitian adalah darah yang diambil melalui vena punksi dari vena mediana cubiti tanpa stasis yang berlebihan. Tempat punksi vena terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 70 dan dibiarkan kering. Darah yang diambil menggunakan spuit disposable syringe 5 cc tanpa antikoagulan, kemudian darah dalam diposable syringe 2,5 cc dimasukkan ke tabung EDTA untuk pemeriksaan darah lengkap, morfologi darah tepi, Hb elektroforesa dan 2,5 cc lagi dimasukkan ke tabung tanpa antikoagulan untuk pemeriksaan SI, TIBC, dan ferritin.

3.6.2. Cara kerja pemeriksaan laboratorium

a. Pemriksaan darah lengkap mengunakan alat electronic counter cell dyne 3700 system. b. Pemeriksaan morfologi darah tepi dengan pembuatan sediaan apus darah tepidan menggunakan pewarnaan Giemsa. c. Pemeriksaan feritin dengan menggunakan alat Cobas 6000 d. Pemeriksaan anlisa hemoglobin dengan metode Hb elektroforesa menggunakan alat semi-automated HYDRASYS System SEBIA Universitas Sumatera Utara pada media gel agarosa pH 8,5 dan kadar fraksi hemoglobin secara relative diukur secara densitometri 3.6.2.a. Pemeriksaan Feritin Prinsip sandwich 1. Inkubasi pertama: 10 ul sampel, antibodi spesifik feritin monoclonal biotinylasi, dan antibody spesifik feritin yang dilebel dengan komplek ruthenium membentuk kompleks sandwich. 2. Inkubasi kedua: setelah ditambahkan streptavidin yang dilapisi mikropartikel, komplek yang terbentuk berikatan dengan fase solid melalui interaksi biotin dengan streptavidin. Campuran reaksi diaspirasi dalam cell pengukur dimana mikropartikel secara magnetic ditangkap pada permukaan elektroda. Substansi yang tidak berikatan dibuang melalui Procell. 3. Aplikasi voltase tegangan pada elektroda kemudian menginduksi emisi chemilukinescent yang diukur oleh photomultiplier. 4. Hasil ditetapkan melalui kurva kalibrasi yang merupakan instrument yang dihasilkan secara khusus oleh kalibrasi 2 titik dan master kurva dihasilkan melalui reagen barcode. 5. Komposisi reagent M mikropartikel yang dilapisi streptavidin 0,72 mgml. R1 anti feritin antibody biotiylasi. Universitas Sumatera Utara R2 anti feritin antibody monoclonal yang dilabel dengan kompleks ruthenium.Sampel specimen: serum. 3.6.2.b. Pemeriksaan analisa hemoglobin Metode : Hb elektroforesa pada pH alkali 8,5 dengan media gel agarosa. Prinsip : Apabila hemoglobin diletakkan pada suatu media penunjang gel agarosa dalam larutan dapar dengan pH alkali 8,5 dalam medan listrik, maka hemoglobin dapat dipisahkan menjadi beberapa fraksi. Fraksi hemoglobintersebut bermigrasi dari katoda ke anoda dengan kecepatan berbeda-beda tergatung besar dan jenis muatan listrik masing-masing. Fraksi hemoglobin kemudian diwarnai dengan amido blackdi mana kadarnya dikuantifikasi secara densitometri pada λ 570 dan digambarkan dalam bentuk electrophoregram. Desitometri adalah modifikasi dari spektrofotometri yaitu menukur cahaya yang di transmisikan oleh media penunjang untuk menentukan konsentrasi dari zat-zat yang mengabsorbsi cahaya yang ada dalam media penunjang tersebut. Sinar monokromatik putih yang melalui media penunjang akan diukur menggunakan photodetector, yang berfungsi untuk mengubah energi cahaya menjadi energi listrik sesusuai dengan intensitas cahaya yang mengenai suatu permukaan yang sensitif. Signal yang dideteksi oleh photodetector merupakan absorbance dari sample yang telah diwarnai pada media penunjang di mana kadarnya menunjukan Universitas Sumatera Utara konsentri sample. Densitometer secara otomatis akan mencatat sebagai grafik dari absorbsi tersebut sebagai area di bawah puncak kurva dan hasilnya sebagai persentasi dari total. Sampel: Darah segar denga antikoagulan EDTA, sitrat atau heparin. Bila diperlukan sample dapat di simpan selama 5 hari pada suhu 2-8 ºC. Bahan dan reagen : 1 Bahan dan reagen dalam kit: • Agarosa gel Merupakan bahan yang siap digunakan. Setiap gel mengandung agarosa 0,8 gdL, buffer alkaline pH 8,5±1 dan bahan-bahan tambahan lain yang tidak berbahaya pada konsentrasi tertentuuntuk hasil yang optimum. Kegunaan sebagai penunjang untuk Hb elektroforesa. • Buffred strip Merupakan sponge buffer yang siap untuk digunakan, mengandung alkaline 9,2±0,2 dan bahan-bahan tambahan lain yang tidak berbahaya pada konsentrasi tertentuuntuk hasil opmtimum. Kegunaan untuk reservoir buffer elektroforesa dan perantara kontak antara gl dan elektroda. • Amidoblack stain Setelah diencerkan dengan air suling, larutan pewarna ini berisi acid solution 0,4 gdL, ethylene glycol 6,7 dan bahan-bahan tambahan Universitas Sumatera Utara lain yang tidak berbahaya pada konsentrasi tertentu untuk hasil yang optimum. Kegunaan untuk mewarnai gel setelah Hb elektroforesa • Hemolysing solution: Merupakan yang siap digunakan, mengandung buffer alkaline dan bahan-bahan tambahan lain yang tidak berbahaya pada konsentrasi tertentu untuk hasil yang optimum. Kegunaan untuk menghemolisa seldarah merah. • Applicator Berguna untuk melakukan pekerjaan, dimana1 applicator untuk 1 sampel. • Filter paper Berguna untuk menghisap kelebihan kelembaban permukaan gel sebelum sample dikerjakan. 2 Destaining solution Mengandung citric acid 0,05 gdL Kegunaan untuk membersihkan kelebihan dan noda latar belakang dari gel, serta membilas kompartemen staining sesudah tahap pencucian. 3 Hydrasys wash solution Mengandung buffer alkaline pH 8,8±0,3 san sodium azide. Kegunaan untuk membersihkan kompartemen staining HYDRASYS. 4 Saline Kegunaan untuk mencuci sel darah merah. Universitas Sumatera Utara Alat-alat : 1 HYDRASYS System SEBIA PN 1210 2 Micropipetttor, manual atau otomatis 3 Wet storage chamber, terdapat dalam alat HYDRASYS 4 Container kit 5 Pipet 10 µl dan 200 µl 6 Densitometerscanner dengan software PHORESIS Persiapan sample: 1 Darah segar denga antikoagulan EDTA disentrifus dengan Kecepatan 5000 rpm selama 5 menit kemudian dipisahkan plasmanya . 2 Cuci sel darah merah dengan 10 volume saline sebanyak 3 Kali. 3 Hemolisiskan 10 µl sel darah merah dengan 130 µl Hemolysing solution. 4 Vortex selama 10 detik dan inkubasikan selama 5 menit pada Temperature kamar. Cara kerja : 1 Masukkan 10 µl hemolisat kedalam masing-masing sumuran well pada applicator. 2 Tempatkan applicator kedalam wet storage chamber. Universitas Sumatera Utara 3 Letakkan bufferedstrip pada electrode carrier. 4 Serap buffr pada gel dengan kertas filter. 5 Beri air 120 µl pada bad migration tempat migrasi kemudian letakkan gel. 6 Letakkan applicator pada applicatorcarrier pada posisi 4. 7 Jalankan alat untuk memulai proses migrasi dan tunggu sampai selesai. 8 Pindahkan gel dari bad migration ke bad staining. 9 Setelah selesai pindahkan gel ke scanner dan di letakkan lurus jangan melengkung. 10 Scan gel dengan software phoresis.

3.6.3. Kontrol kualitas

Kontrol kualitas untuk ferritin dilakukan elecsys Preci Control tumor Marker 1 dan 2, dilakukan setiap 24 jam, setiap pemakaian reagent kit baru dan setelah selesai kalibrasi. Nilai konsentrasi kontrol harus masuk dalam range yang ditetapkan untuk menjamin akurasi assay feritin. Untuk menentukan migrasi menyertakan setiap pemeriksaan dengan sample control darah normal dan abnormal yang sudah diketahui. Sampel control berasal dari penderita di RSUP H. Adam Malik Medan yang disimpan dalam aliquot dan dibekukan hingga saat pemeriksaan maksimum selama 1 minggu. Sebelum dilakukan pemeriksaan sampel Universitas Sumatera Utara penelitian, dilakukan pemeriksaan sampel control normal dan abnormal terlebih dahulu untuk memastikan kualitas kontrol masih baik. 3.7. Ethical clearance dan informed consent Ethical clearance diperoleh dari Komite Penelitian Bidang Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. Inform consent diminta secara tertulis dari subjek penelitian atau diwakili oleh kelurganya yang ikut bersedia dalam penelitian setelah mendapat penjelasan mengenai maksud dan tujuan penelitian ini. Universitas Sumatera Utara

3.8 Kerangka operasional

Darah lengkap Hb ↓,Hct↓,RBC↓,MC H ↓,MCV↓,MCHC↓ Hb elekroforesis Densitometri Anemia defisiensi besi Kimia Klinik SI ↓,TIBC↑N, Feritin ↓ Apus Darah Tepi Bentuk Eritrosit Abnormal Hasil dari HbA,HbA2,HbF Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL PENELITIAN

Selama periode september 2010 sampai dengan November 2010 telah dilakukan penelitian secara cross sectional dengan memeriksa kadar HbA2 pada 30 orang penderita anemia defisiensi besi yang dirawat diruang penyakit dalam RSUP H ADAM MALIK medan dan sebagai kontrol 30 orang normal sehat. Dari hasil penelitian didapatkan penderita anemia defisiensi besi 14 orang laki-laki 46,7 dan 16 orang perempuan 53,3, sedangkan pada kontrol dijumpai 16 orang laki-laki 53,3 dan 14 orang perempuan 46,7. Hasil seperti terlihat pada tabel 1 uji statistik menunjukan tak ada perbedaan antara kelompok pasien dengan kontrol p 0,05 . Universitas Sumatera Utara