normal. Sedangkan untuk melihat korelasi antar variabel digunakan korelasi Pearson.
3.6 BAHAN DAN CARA KERJA 3.6.1 Bahan dan pengolahan sampel
Bahan penelitian adalah darah yang diambil melalui vena punksi dari vena mediana cubiti tanpa stasis yang berlebihan. Tempat punksi vena
terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 70 dan dibiarkan kering. Darah yang diambil menggunakan spuit disposable syringe 5 cc tanpa
antikoagulan, kemudian darah dalam diposable syringe 2,5 cc dimasukkan ke tabung EDTA untuk pemeriksaan darah lengkap, morfologi darah tepi,
Hb elektroforesa dan 2,5 cc lagi dimasukkan ke tabung tanpa antikoagulan untuk pemeriksaan SI, TIBC, dan ferritin.
3.6.2. Cara kerja pemeriksaan laboratorium
a. Pemriksaan darah lengkap mengunakan alat electronic counter cell dyne 3700 system.
b. Pemeriksaan morfologi darah tepi dengan pembuatan sediaan apus darah tepidan menggunakan pewarnaan Giemsa.
c. Pemeriksaan feritin dengan menggunakan alat Cobas 6000 d. Pemeriksaan anlisa hemoglobin dengan metode Hb elektroforesa
menggunakan alat semi-automated HYDRASYS System SEBIA
Universitas Sumatera Utara
pada media gel agarosa pH 8,5 dan kadar fraksi hemoglobin secara relative diukur secara densitometri
3.6.2.a. Pemeriksaan Feritin
Prinsip sandwich 1. Inkubasi pertama: 10 ul sampel, antibodi spesifik feritin
monoclonal biotinylasi, dan antibody spesifik feritin yang dilebel dengan komplek ruthenium membentuk kompleks sandwich.
2. Inkubasi kedua: setelah ditambahkan streptavidin yang dilapisi mikropartikel, komplek yang terbentuk berikatan dengan fase
solid melalui interaksi biotin dengan streptavidin. Campuran reaksi diaspirasi dalam cell pengukur dimana mikropartikel
secara magnetic ditangkap pada permukaan elektroda. Substansi yang tidak berikatan dibuang melalui Procell.
3. Aplikasi voltase tegangan pada elektroda kemudian menginduksi emisi chemilukinescent yang diukur oleh
photomultiplier. 4. Hasil ditetapkan melalui kurva kalibrasi yang merupakan
instrument yang dihasilkan secara khusus oleh kalibrasi 2 titik dan master kurva dihasilkan melalui reagen barcode.
5. Komposisi reagent M
mikropartikel yang dilapisi streptavidin 0,72 mgml. R1
anti feritin antibody biotiylasi.
Universitas Sumatera Utara
R2 anti feritin antibody monoclonal yang dilabel dengan
kompleks ruthenium.Sampel specimen: serum.
3.6.2.b. Pemeriksaan analisa hemoglobin
Metode : Hb elektroforesa pada pH alkali 8,5 dengan media gel agarosa. Prinsip : Apabila hemoglobin diletakkan pada suatu media penunjang gel
agarosa dalam larutan dapar dengan pH alkali 8,5 dalam medan listrik, maka hemoglobin dapat dipisahkan menjadi beberapa fraksi. Fraksi
hemoglobintersebut bermigrasi dari katoda ke anoda dengan kecepatan berbeda-beda tergatung besar dan jenis muatan listrik masing-masing. Fraksi
hemoglobin kemudian diwarnai dengan amido blackdi mana kadarnya dikuantifikasi secara densitometri pada
λ 570 dan digambarkan dalam bentuk
electrophoregram. Desitometri adalah modifikasi dari spektrofotometri yaitu menukur cahaya yang di transmisikan oleh media penunjang untuk
menentukan konsentrasi dari zat-zat yang mengabsorbsi cahaya yang ada dalam media penunjang tersebut. Sinar monokromatik putih yang melalui
media penunjang akan diukur menggunakan photodetector, yang berfungsi untuk mengubah energi cahaya menjadi energi listrik sesusuai dengan
intensitas cahaya yang mengenai suatu permukaan yang sensitif. Signal yang dideteksi oleh photodetector merupakan absorbance dari sample yang
telah diwarnai pada media penunjang di mana kadarnya menunjukan
Universitas Sumatera Utara
konsentri sample. Densitometer secara otomatis akan mencatat sebagai grafik dari absorbsi tersebut sebagai area di bawah puncak kurva dan
hasilnya sebagai persentasi dari total. Sampel: Darah segar denga antikoagulan EDTA, sitrat atau heparin.
Bila diperlukan sample dapat di simpan selama 5 hari pada suhu 2-8 ºC. Bahan dan reagen :
1 Bahan dan reagen dalam kit: • Agarosa gel
Merupakan bahan yang siap digunakan. Setiap gel mengandung agarosa 0,8 gdL, buffer alkaline pH 8,5±1 dan bahan-bahan tambahan
lain yang tidak berbahaya pada konsentrasi tertentuuntuk hasil yang optimum. Kegunaan sebagai penunjang untuk Hb elektroforesa.
• Buffred strip Merupakan sponge buffer yang siap untuk digunakan, mengandung
alkaline 9,2±0,2 dan bahan-bahan tambahan lain yang tidak berbahaya pada konsentrasi tertentuuntuk hasil opmtimum. Kegunaan
untuk reservoir buffer elektroforesa dan perantara kontak antara gl dan elektroda.
• Amidoblack stain Setelah diencerkan dengan air suling, larutan pewarna ini berisi acid
solution 0,4 gdL, ethylene glycol 6,7 dan bahan-bahan tambahan
Universitas Sumatera Utara
lain yang tidak berbahaya pada konsentrasi tertentu untuk hasil yang optimum. Kegunaan untuk mewarnai gel setelah Hb elektroforesa
• Hemolysing solution: Merupakan yang siap digunakan, mengandung buffer alkaline dan
bahan-bahan tambahan lain yang tidak berbahaya pada konsentrasi tertentu untuk hasil yang optimum. Kegunaan untuk menghemolisa
seldarah merah. • Applicator
Berguna untuk melakukan pekerjaan, dimana1 applicator untuk 1 sampel.
• Filter paper Berguna untuk menghisap kelebihan kelembaban permukaan gel
sebelum sample dikerjakan. 2 Destaining solution
Mengandung citric acid 0,05 gdL Kegunaan untuk membersihkan kelebihan dan noda latar belakang dari
gel, serta membilas kompartemen staining sesudah tahap pencucian. 3 Hydrasys wash solution
Mengandung buffer alkaline pH 8,8±0,3 san sodium azide. Kegunaan untuk membersihkan kompartemen staining HYDRASYS.
4 Saline Kegunaan untuk mencuci sel darah merah.
Universitas Sumatera Utara
Alat-alat : 1 HYDRASYS System SEBIA PN 1210
2 Micropipetttor, manual atau otomatis 3 Wet storage chamber, terdapat dalam alat HYDRASYS
4 Container kit 5 Pipet 10 µl dan 200 µl
6 Densitometerscanner dengan software PHORESIS
Persiapan sample: 1 Darah segar denga antikoagulan EDTA disentrifus dengan
Kecepatan 5000 rpm selama 5 menit kemudian dipisahkan plasmanya .
2 Cuci sel darah merah dengan 10 volume saline sebanyak 3 Kali.
3 Hemolisiskan 10 µl sel darah merah dengan 130 µl Hemolysing solution.
4 Vortex selama 10 detik dan inkubasikan selama 5 menit pada Temperature kamar.
Cara kerja : 1 Masukkan 10 µl hemolisat kedalam masing-masing sumuran
well pada applicator. 2 Tempatkan applicator kedalam wet storage chamber.
Universitas Sumatera Utara
3 Letakkan bufferedstrip pada electrode carrier. 4 Serap buffr pada gel dengan kertas filter.
5 Beri air 120 µl pada bad migration tempat migrasi kemudian letakkan gel.
6 Letakkan applicator pada applicatorcarrier pada posisi 4. 7 Jalankan alat untuk memulai proses migrasi dan tunggu
sampai selesai. 8 Pindahkan gel dari bad migration ke bad staining.
9 Setelah selesai pindahkan gel ke scanner dan di letakkan lurus jangan melengkung.
10 Scan gel dengan software phoresis.
3.6.3. Kontrol kualitas
