Lokasi dan Waktu Penelitian Alat dan Bahan Penelitian Determinasi Tanaman

15 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kimia dan Mikrobiologi Gedung Produk Makanan dan Kesehatan Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi P3TIR, Badan Tenaga Nuklir Nasional BATAN, Pasar Jumat, Jakarta Selatan dan Laboratorium PMC Pharmacy Medicinal Chemistry, FKIK UIN Jakarta. Penelitian dimulai bulan Mei hingga bulan Desember 2012.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan meliputi Iradiator Karet Alam IRKA, laminar air flow Envair, lemari pendingin Kelvinator, inkubator Heraeus, oven listrik Heraeus, rotary evaporator Hahnvapor, mikroskop elektrik Nikon Labophot, hot plate Quebec, timbangan analitik Sartorius, erlenmeyer 50 mL, 250 mL dan 500 mL, alumunium foil, tabung reaksi 10 mL dan 20 mL, botol kaca, cawan petri diameter 9 cm dan 15 cm, batang pengaduk, drugalsky, spatel logam, pipet volume 0,1 mL; 0,2 mL; 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL dan 25 mL, jarum ose, pinset, dan silinder stainless steel 6,0 mm.

3.2.2 Bahan

Tanaman uji yang digunakan adalah rimpang temu putih yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Rempah Balittro dan herba sambiloto diperoleh dari kebun yang dibudidayakan BATAN. Bakteri: Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923. Pelarut, pereaksi dan zat warna: HCl, amonia encer, kloroform, pereaksi Mayer, pereaksi Draggendorff, Bouchardat, etil asetat, FeCl 3, asam sulfat pekat H 2 SO 4 , aquadest, etanol 96, etanol 10, kristal violet, larutan lugol, safranin, Kanamycin. Medium perbenihan bakteri: Nutrient agar, Tryptic soy agar, dan Tryptic soy broth. 16 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Determinasi Tanaman

Bahan uji dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Cibinong.

3.3.2 Pembuatan Ekstrak Temu Putih dan Sambiloto

Pembuatan serbuk dari sampel segar dilakukan di Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Balittro. Sebanyak 1300 g serbuk temu putih dan 1000 g serbuk sambiloto dimasukkan ke dalam wadah kemudian ditambah etanol 96 sebanyak 1:4 bv dan didiamkan selama minimal 24 jam sambil sesekali diaduk. Maserat disaring lalu dipekatkan dengan menggunakan penguap berputar rotary evaporator pada suhu 50 C. Proses diulangi sebanyak 3 kali untuk serbuk temu putih dan 5 kali untuk serbuk sambiloto hingga diperoleh filtrat tidak berwarna. Masing-masing ekstrak dimasukkan ke dalam wadah gelas steril, dimana tiap ekstrak dibagi menjadi 2 tempat yaitu untuk ekstrak non iradiasi dan ekstrak hasil iradiasi. Ekstrak diiradiasi dengan dosis 10 kGy di Iradiator Karet Alam IRKA, Badan Tenaga Nuklir Nasional BATAN, Pasar Jumat, Jakarta Selatan.

3.3.3 Karakterisasi dan Penapisan Fitokimia Ekstrak Temu Putih dan

Sambiloto Karakterisasi bahan uji dilakukan sesuai dengan standar yang ditetapkan dalam Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat 2000 sebagai berikut:

3.3.3.1 Parameter spesifik:

a. Pengamatan secara organoleptik dilakukan terhadap bentuk, warna, dan bau dari ekstrak temu putih dan sambiloto. b. Senyawa terlarut dalam pelarut tertentu Pengujian senyawa terlarut terdiri dari kadar senyawa yang larut dalam air dan kadar senyawa yang larut dalam etanol. Caranya: sebanyak 5,0 g ekstrak temu putih dan sambiloto masing-masing dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Untuk penentuan senyawa terlarut dalam air, ekstrak di maserasi dengan 100 ml campuran air-kloroform 2,5 mL kloroform dalam 1000 mL air sedangkan untuk penentuan senyawa terlarut dalam 17 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta etanol, ekstrak di maserasi dengan 100 mL etanol 96. Kemudian dikocok selama 6 jam pertama dan dibiarkan selama 18 jam. Lalu disaring dan filtrat diambil sebanyak 20 mL, diuapkan hingga kering, sisanya dipanaskan pada suhu 105 C hingga bobot tetap. Kadar dalam persen senyawa yang larut dalam air maupun etanol dihitung terhadap ekstrak awal. Kadar sari yang terlarut = berat ekstrak setelah di oven g � 5 berat ekstrak awal g x 100

3.3.3.2 Parameter non spesifik:

a. Penetapan susut pengeringan Sebanyak 2 g ekstrak temu putih dan sambiloto masing-masing dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 C selama 30 menit dan telah ditara. Kemudian dimasukkan ke dalam oven, tutupnya dibuka, dikeringkan pada suhu 105 C selama 15 jam hingga diperoleh bobot tetap. Kadar dihitung dalam persen, susut pengeringan dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara, dengan rumus: Persen susut pengeringan = kehilangan bobot g bobot awal sampel g x 100 b. Penetapan kadar abu Sebanyak 2 g ekstrak temu putih dan sambiloto masing-masing dimasukkan ke dalam kurs porselin. Dipijarkan perlahan-lahan hingga suhu mencapai 675 C selama 13 jam hingga arang habis, didinginkan, lalu ditimbang dan diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Kadar abu total = berat abu sisa pijar g berat ekstrak g � 100 c. Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam Abu yang diperoleh dari penetapan kadar abu, dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer P selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu Whatman no. 42 lalu dicuci dengan air panas dan dipijarkan pada suhu 675 C selama 12 18 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta jam hingga diperoleh bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Kadar abu tidak larut asam = berat abu sisa pijar g berat ekstrak g � 100

3.3.3.3 Penapisan Fitokimia Ekstrak Temu Putih dan Sambiloto Gacche

et al., 2011 a. Uji Alkaloid Sebanyak 0,5 g ekstrak temu putih dan sambiloto masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambah dengan 1 mL HCl 2 N dan 9 mL aquadest. Ekstrak tersebut dipanaskan selama 2 menit, didinginkan, dan disaring. Filtrat dipisahkan menjadi 2 bagian, masing- masing ditambahkan dengan pereaksi Bouchardat dan pereaksi Mayer. Adanya endapan berwarna putih dengan reagen Mayer atau endapan coklat sampai hitam dengan Bouchardat menunjukkan adanya alkaloid. b. Uji Flavonoid Sebanyak 0,5 g ekstrak temu putih dan sambiloto masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambah dengan 10 mL etil asetat. Ekstrak tersebut dipanaskan sampai mendidih selama 3 menit, didinginkan, dan disaring. Sebanyak 4 mL filtrat diambil dan ditambahkan dengan 1 mL larutan amonia encer lalu dikocok. Warna kuning menunjukkan adanya flavonoid. c. Uji Tanin Sebanyak 0,5 g ekstrak temu putih dan sambiloto masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambah dengan 10 mL aquadest. Ekstrak tersebut dipanaskan sampai mendidih selama 2 menit kemudian disaring dan ditambah beberapa tetes FeCl 3 , terbentuk warna hijau kecoklatan atau biru-hitam menunjukkan adanya tanin. d. Uji Saponin Sebanyak 0,5 g ekstrak temu putih dan sambiloto masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 10 mL aquadest. Ekstrak tersebut dipanaskan sampai mendidih selama 2 menit kemudian disaring dan dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuk buih yang 19 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mantap selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 cm sampai 10 cm. Pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, buih tidak hilang. e. Uji Terpenoid Sebanyak 0,5 g ekstrak ditambah 2 mL kloroform. Kemudian ditambahkan H 2 SO 4 pekat dengan hati-hati untuk membentuk lapisan. Lapisan berwarna coklat kemerahan menunjukkan adanya terpenoid. f. Uji Fenol Sebanyak 0,5 g ekstrak temu putih dan sambiloto masing-masing dimasukkan ke dalam plat tetes kemudian ditambahkan 1-2 tetes FeCl 3 5. Terbentuk peningkatan intensitas warna hijau sampai biru menunjukkan adanya fenolik.

3.3.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Temu Putih, Ekstrak

Sambiloto, dan Kombinasi Ekstrak Temu Putih-Sambiloto TS Metode Difusi Silinder Metode difusi silinder digunakan untuk menentukan aktivitas antibakteri dari ekstrak temu putih, ekstrak sambiloto, dan TS 1:1 terhadap 2 strain Gram- positif B. subtilis dan S. aureus. Masing-masing ekstrak dilarutkan dalam etanol 10. Silinder stainless steel 6 mm diletakkan di atas permukaan lempeng agar yang telah ditanami bakteri. Kemudian masing-masing ekstrak yaitu ekstrak temu putih, ekstrak sambiloto, dan TS baik non iradiasi maupun hasil iradiasi diteteskan menggunakan mikropipet sebanyak 50 µ L ke dalam silinder dengan 3 seri ekstrak uji 10 µg, 100 µg, dan 1000 µg. Selanjutnya cawan petri diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Kanamycin 30 µg sebagai positif kontrol sedangkan etanol 10 sebagai kontrol negatif. Penilaian aktivitas antibakteri berdasarkan pada pengukuran diameter zona hambat mm yang terbentuk di sekitar silinder dan dihitung menggunakan mistar. Klasifikasi kategori zona hambat Devi et al., 2007: 12 mm : kuat 9-12 mm : sedang 6-9 mm : lemah 6 mm : resisten 20 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri TS Metode Dilusi Agar

Metode dilusi agar digunakan untuk menentukan konsentrasi hambat minimum TS non iradiasi dan hasil iradiasi. Media pertumbuhan triptic soy agar TSA disiapkan dan disterilisasi dalam autoklaf. Media yang telah steril dibiarkan hingga suhunya turun ±50 C. Sebanyak 2 mL ekstrak uji pada tiap konsentrasi 62,5 µgmL, 125 µgmL, 250 µgmL, 500 µgmL, dan 1000 µgmL ditambahkan ke dalam 18 mL media agar kemudian dicampur hingga homogen. Campuran tersebut dituang ke dalam cawan petri steril lalu didinginkan hingga memadat. Sebanyak 1 ose suspensi bakteri 10 5 - 10 6 CFUmL diinokulasikan di atas permukaan agar padat dan diratakan menggunakan drugalsky kemudian diinkubasikan pada suhu 37 C selama 24 jam. Pengamatan dilihat berdasarkan jumlah koloni yang tumbuh pada setiap ekstrak uji dan dibandingkan dengan kontrol negatif sehingga diperoleh hambatan. Konsentrasi ekstrak terendah yang menunjukkan hambatan ≥ 99 dinamakan sebagai KHM Sule et al., 2011. Perhitungan hambatan pertumbuhan bakteri = Ko −K1 Ko x 100 Ket: Ko = jumlah koloni pada media tanpa ekstrak K1 = jumlah koloni pada media yang diisi ekstrak Petzer et al., 2013 21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Tanaman

Hasil determinasi tanaman dapat dilihat pada lampiran 3 dan lampiran 4 yang menunjukkan bahwa sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman temu putih Curcuma zedoaria Christm. Roscoe. dan sambiloto Andrographis paniculata Ness. Tanaman uji dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Cibinong. Tanaman temu putih dan sambiloto dideterminasi untuk memastikan kebenaran jenis tumbuhan mengenai spesies dan famili tumbuhan tersebut sehingga mampu memberikan informasi yang jelas dan benar bahwa sampel tumbuhan yang diteliti adalah sesuai tujuan penelitian.

4.2 Pembuatan Ekstrak Temu Putih dan Sambiloto