III. METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari hingga Maret 2009, bertempat di laboratorium Kesehatan Ikan, Balai Besar Pengembangan Budidaya
Air Tawar BBPBAT Sukabumi, Jawa Barat dan Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut
Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah akuarium 40x40x60cm, alat suntik syringe, gelas objek, gelas penutup, eppendorf, hemometer, pipet sahli, tabung
hematokrit sentrifuse, penggaris, haemacytometer tipe Neubauer, mikroskop, kertas tisu.
Bahan yang digunakan adalah ikan mas strain wildan yang berasal dari daerah Cianjur, minyak cengkeh, darah ikan, antikoagulan Na-sitrat 3,8,
larutan HCl 0.1 N, akuades, crytoseal , larutan Hayem’s, larutan Turk’s, bakteri
Staphylococcus aureus, PBS, larutan methanol, pewarna Giemsa.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Persiapan Wadah
Wadah yang digunakan adalah akuarium 40x40x60 cm. Akuarium yang digunakan terlebuh dahulu dibersihkan kemudian dikeringkan. Setelah itu
disemprot klorin dan dibiarkan kering udara. Akuarium diisi air setinggi 30 cm dan diberi aerasi.
3.3.2 Persiapan Ikan Uji
Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas strain wildan dari daerah Cianjur. Selama beberapa hari ikan diadaptasikan terlebih dahulu sebelum perlakuan.
Jumlah ikan yang digunakan sebanyak 60 ekor per perlakuan. Kemudian jumlah ikan dibagi 2 masing-masing 30 ekor pada pengamatan status kelangsungan
hidup ikan dan haematologi. Selama masa adaptasi maupun perlakuan ikan diberi pakan berupa pelet sebanyak 2 kali sehari yaitu pagi dan sore.
3.3.3 Penyuntikan Vaksin DNA
Penyuntikan dilakukan secara intramuskular, dengan tiga tingkatan dosis yaitu 2.5 µg100µl, 7.5 µg100µl dan 12.5 µg100µl. Adapun kelompok
perlakuannya yaitu :
Perlakuan A : Ikan disuntik dengan vaksin DNA dosis 2,5 µg100µl
Perlakuan B : Ikan disuntik dengan vaksin DNA dosis 7,5 µg100µl Perlakuan C : Ikan disuntik dengan vaksin DNA dosis 12,5 µg100µl
Kontrol K : Ikan kontrol positif Setelah vaksinasi, ikan dipelihara selama 42 hari 6 minggu.
3.3.4 Penyediaan suspensi KHV
Sebanyak satu gram insang yang terinfeksi KHV digerus kemudian disuspensikan dengan 9 ml larutan PBS. Lalu disentrifus dengan kecepatan 5000
rpm selama 30 menit dengan suhu 5
o
C. Supernatan yang dihasilkan diambil dan disaring dengan kertas milipore 0.45 µm sehingga didapat konsentrasi virus
dengan konsentrasi 20, kemudian dilakukan pengenceran sampai 10
-3
.
3.3.5 Uji Tantang
Ikan yang telah divaksin dan telah dipelihara selama 6 minggu 42 hari kemudian diuji tantang untuk melihat respon kekebalannya. Uji tantang dilakukan
dengan menginjeksi virus aktif dengan konsentrasi pengenceran 10
-3
, sebanyak 0,1 ml secara intramuskular ke semua ikan uji.
3.4 Metode Pengukuran Hematologi 3.4.1 Pengambilan Darah
Pengambilan darah dilakukan setiap seminggu sekali selama pemeliharaan setelah vaksinasi dan uji tantang. Sebelum pengambilan darah, ikan terlebih
dahulu dibius dengan minyak cengkeh dosis 0.04 ppt. Pada pengambilan darah,
ikan diletakkan dengan kepala disebelah kiri, sebelumnya alat suntik sudah dibilas
dengan Na-sitrat sedikit, kemudian darah diambil pada bagian vena caudalis yaitu pembuluh darah yang terletak tepat dibagian ventral tulang vertebrae tulang
punggung. Jarum ditusukan di antara anus dan sirip anal. Lalu jarum ditarik sedikit kemudian darah dihisap sampai batas yang diinginkan. Setelah itu alat
suntik dicabut kemudian darah ditempatkan ke dalam eppendorf.
3.4.2 Perhitungan Kadar Hemoglobin
Pengukuran kadar Hemoglobin Hb dilakukan dengan metode Sahli yang mengkonversi darah ke dalam bentuk asam hematin setelah darah ditambah
dengan asam klorida. Pertama darah dihidap dengan pipet sahli sampai skala 20 mm
3
atau pada skala 0.02 ml, kemudian darah dipindahkan ke dalam tabung Hb- meter yang telah diisi HCl 0.1 N sampai skala 10, aduk dan dibiarkan selama 3
– 5 menit.
Setelah itu aquades ditambahkan sampai warna darah dan HCl tersebut seperti warna larutan standar yang ada dalam Hb meter tersebut. Skala dibaca
dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung sahli yang dilihat pada skala jalur gr kuning yang berarti banyaknya hemoglobin dalam
gram per 100 ml darah.
3.4.3 Perhitungan Kadar Hematokrit Chinabut et al. 1991
Darah dihisap dengan tabung mikrohematokrit sampai mencapai ¾ bagian tabung. Kemudian ujung tabung ditutup dengan crytoseal sedalam kira-kira 1 mm,
sehingga terbentuk sumbat crytoseal. Lalu tabung mikrohematokrit disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit dengan posisi tabung yang bervolume
sama berhadapan agar putaran sentrifuse seimbang. Nilai kadar hematokrit ditentukan dengan persentase panjang bagian darah yang mengendap a serta
panjang total volume darah yang terdapat di dalam tabung b : ab x 100. Kadar hematokrit ini mencerminkan banyaknya sel darah digambarkan dengan
endapanpadatan dalam cairan darah.
3.4.4 Penghitungan Total Eritrosit Svobodova Vyukusova 1991
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna merah sampai skala 0,5
. Lalu tambahkan larutan Hayem’s berfungsi untuk mematikan sel-sel darah putih sampai skala 101, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan
dengan mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka delapan selama 3
– 5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan pertama larutan darah dalam pipet dibuang, selanjutnya teteskan pada
haemacytometer tipe Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah merah dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran 400 x. Jumlah
eritrosit total dihitung pada 5 kotak kecil haemacytometer dan jumlahnya di hitung dengan rumus Nabib Pasaribu 1989 :
Jumlah eritrosit : AN x 1V x Fp Keterangan :
A = ∑ sel terhitung V = volume kotak haemacytometer
N = ∑ kotak haemacytometer yang diamati Fp = Faktor pengenceran
3.4.5 Penghitungan Total Leukosit Svobodova Vyukusova 1991
Darah dihisap dengan pipet yang berisi bulir pengaduk warna putih sampai skala 0,5
. Lalu tambahkan larutan Turk’s berfungsi untuk mematikan sel-sel darah merah sampai skala 11, pengadukan darah di dalam pipet dilakukan dengan
mengayunkan tangan yang memegang pipet seperti membentuk angka delapan selama 3
– 5 menit sehingga darah tercampur rata. Setelah itu tetesan pertama larutan darah dalam pipet dibuang, selanjutnya teteskan pada haemacytometer tipe
Neubauer kemudian ditutup dengan gelas penutup. Jumlah sel darah putih dengan bantuan mikroskop dengan perbesaran 400 x. Jumlah leukosit total dihitung
sebanyak 5 kotak besar dan dan jumlahnya dihitung dengan rumus : Total Leukosit = jumlah sel terhitung x 50 selmm
3
3.4.6 Pembuatan Preparat Ulas Darah Svobodova Vyukusova 1991
Sebelumnya gelas objek yang akan digunakan direndam dalam methanol untuk menghilangkan lemak yang menempel. Pembuatan preparat ulas darah
dilakukan dengan menempatkan setetes darah pada gelas objek, gelas objek kedua diletakan dengan suduk 45
o
terhadap gelas objek pertama, kemudian digeser ke belakang sehingga menyentuh darah, kemudian gelas objek kedua digeser
berlawanan arah sehingga membentuk lapisan tipis darah. Selanjutnya preparat dikering-udarakan kemudian difiksasi dengan metanol selama 5 menit. Kemudian
preparat dibilas dengan akuades dan dikering udarakan kembali sebelum diwarnai dengan pewarna Giemsa selama 15 menit. Lalu preparat dicuci kembali dengan
akuades untuk mengurangi kelebihan warna dan dikeringkan dengan tisu. Setelah itu diamati di bawah mikroskop. Persentase sel-sel leukosit dihitung dengan cara
mengamati sebanyak 10 lapang pandang dan masing-masing jenis leukosit yang terhitung dikelompokan dan dipersentasi menurut jenisnya, satuannya adalah
persen .
3.4.7 Indeks Fagositik
Sebanyak 50 µ l darah dimasukan ke dalam mikrotiter plate, ditambahkan 50 µ l suspensi Staphylococcus aureus dalam PBS 10
8
selml, dihomogenkan dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 20 menit. Setelah itu sebanyak 5 µ l dibuat
sediaan ulas darah dan dikering-udarakan. Lalu difiksasi dengan metanol selama 5 menit dan dikeringkan. Kemudian direndam dalam pewarna Giemsa selama 15
menit. Lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan tisu. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x. Jumlah sel yang
menunjukan proses fagostosis dihitung dari 100 sel fagosit yang teramati.
3.5 Analisa Data
Data yang telah diperoleh dianalisis menggunakan SPSS ver 15.0 untuk uji Analisis Ragam ANOVA dengan uji F pada selang kepercayaan 95, untuk
menentukan apakah perlakuan berpengaruh nyata terhadap gambaran darah ikan. Apabila berpengaruh nyata, untuk melihat perbedaan antar perlakuan akan diuji
lanjut dengan uji lanjutan Duncan. Garis regresi dibuat hanya pada perlakuan yang berbeda nyata dan memiliki nilai korelasi yang tinggi 0.3 untuk
mengetahui hubungan antara dosis dengan parameter hematologi.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil 4.1.1 Total Leukosit
Jumlah total rata-rata leukosit dalam darah ikan mas yang dipelihara
selama 70 hari berkisar antara 27.2±6.3-127±11.3 x10
3
selmm
3
Tabel 2 dan 3. Nilai tertinggi dicapai pada perlakuan B dosis 7,5 µg100µl yaitu 127±11.3
x10
3
selmm
3
pada hari ke-42 setelah ikan divaksinasi. Nilai terendah terdapat perlakuan A dosis 2,5 µg100µl yaitu 27.2±6.3 x10
3
selmm
3
, pada hari ke-49 seminggu setelah uji tantang. Dari analisa statistik ragam ANOVA dan uji
lanjutan Duncan pada selang kepercayaan 95 p0,05, diperoleh hasil bahwa pada masa vaksinasi perlakuan kontrol berbeda nyata dengan perlakuan B pada
hari ke-21 dan 42, namun pada hari ke-28 perlakuan kontrol berbeda nyata dengan perlakuan A dan B Tabel 2. Sedangkan setelah ikan diuji tantang diinfeksi
KHV jumlah rataan leukosit masing-masing perlakuan tidak berbeda nyata
Tabel 3. Tabel 2. Jumlah Rataan Leukosit Pada Setiap Perlakuan x 10
3
selmm
3
Selama Vaksinasi
Perlakuan Masa Vaksinasi hari
7 14
21 28
35 42
A
43.8±15 33.6±7.5
44.8±16.1
ab
86±4.4
c
82.7±4.3 100±8.5
ab
B
35.7±18.5 44±9.1
68.1±16.1
b
73.7±18.3
bc
82.3±3.9 127±11.3
b
C
58.9±2.9 42.5±7.8
54.1±9.2
ab
52.9±31.6
ab
90.1±36.5 101±49.7
ab
K
27.6±8.2 31.3±16.7
33.7±4.4
a
43.6±11.6
a
77.5±12.2 76±9.6
a
Keterangan : Huruf superscrift yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan pengaruh berbeda nyata p0,05
Tabel 3. Jumlah Rataan Leukosit Pada Setiap Perlakuan x 10
3
selmm
3
Selama Uji Tantang
Perlakuan Masa Uji Tantang hari
49 56
63 70
A
27.2±6.3 36.9±10.4
46.7±4.5
B
46.5±8.4 32.1±17.3
50.5±4.5
C
44.2±11.1 33±6.9
51.9±3.1 57.6±1.9
K
45.9±10.1 45±12.9
47.7±5.1