OPTIMALISASI PROTOKOL PERBANYAKAN IN VITRO

tricolor x Vanda Pteroceras validum dihasilkan pada medium MS + 2 arang aktif + 150 g L -1 bubur pisang Ambon + 5 ppm kinetin + 1 ppm 2,4-D Romeida dan Yuliasari 2004. Seleksi Formulasi Vitamin, Gula dan Sitokinin. Modifikasi komposisi medium tanam dengan mengubah formulasi komposisi vitamin dan konsentrasi gula yang diberikan ke dalam medium MS memberikan pengaruh yang berbeda nyata pada taraf uji F 5 terhadap peubah jumlah plb, jumlah planlet, jumlah akar dan tinggi planlet. Penambahan berbagai jenis dan konsentrasi sitokinin pada medium MS juga memberikan pengaruh yang berbeda nyata pada taraf uji F 5 terhadap jumlah plb, jumlah planlet dan tinggi planlet pada 6 mst, namun interaksi antar perlakuan tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap semua peubah yang diamati. Berdasarkan hasil UJBD pada taraf 5, modifikasi formulasi vitamin B5 dengan konsentrasi gula 30 g L -1 merupakan formulasi terbaik dalam multiplikasi plb anggrek S. plicata. Kombinasi perlakuan tersebut mampu menghasilkan multiplikasi plb tertinggi dan berbeda nyata dengan ketiga kombinasi perlakuan lainnya, dengan kriteria jumlah plb terbanyak yaitu 31 plbbotol. Jumlah plb yang berkembang menjadi planlet juga sangat tinggi yaitu 13.1 planletbotol Tabel 5. Tabel 5. Pengaruh formulasi komposisi vitamin dan konsentrasi gula medium terhadap pertumbuhan dan perkembangan plb anggrek S. plicata pada 6 mst. Komposisi vitamin dan konsentrasi gula Jumlah plb plb botol Jumlah planlet planlet botol Jumlah daun helai Jumlah akar Tinggi planlet cm Vitamin MS + gula 30 g L -1 19.20 b 4.30 b 3.50 2.10 ab 2.70 c Vitamin B5 + gula 30 g L -1 31.00 a 13.10 a 4.40 1.70 ab 4.10 bc Vitamin MS + gula 40 g L -1 10.00 c 2.00 c 3.90 1.10 b 3.00 bc Vitamin B5 + gula 40 g L -1 10.80 c 2.50 c 3.70 2.80 a 6.80 a Keterangan : Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata pada UJBD dengan α = 0.05 Gambar 5. Pengaruh formulasi jenis vitamin dan konsentrasi gula medium MS terhadap multiplikasi plb anggrek S. plicata pada 6 mst. Kiri : modifikasi vitamin VMS = vitamin MS, VB5 = vitamin B5. Kanan : modifikasi gula G30 = gula 30 g L -1 , G40 = gula 40 gL -1 . JPLB = jumlah plb, JPLT = jumlah planlet, JD = jumlah daun. JA = jumlah akar, TT = tinggi tanaman. Gambar 6. Pengaruh modifikasi vitamin dan konsentrasi gula terhadap penampilan plb dan planlet anggrek S. plicata pada 6 mst, VMS = vitamin MS, VB5 = vitamin B5, G30 = gula 30 g L -1 , G40 = gula 40 g L -1 . Jumlah plb dan planlet merupakan indikator untuk taraf multiplikasi dan sangat penting dalam produksi massal bahan tanam, sementara jumlah akar terbanyak 2.8 akarplanlet dan tinggi planlet tertinggi 6.8 cm dihasilkan dari modifikasi vitamin B5 dengan peningkatan konsentrasi gula medium menjadi 40 g L -1 Tabel 5 dan Gambar 5. Penampilan visual hasil pengamatan kualitatif seperti bentuk dan warna plb dan planlet serta penampilan dari keseluruhan hasil modifikasi vitamin dan konsentrasi gula disajikan pada Gambar 6. Penggunaan vitamin B5 untuk menggantikan vitamin MS pada medium MS memberikan pengaruh yang lebih baik dibandingkan dengan vitamin MS standar dalam multiplikasi plb. Jumlah plb akhir rata-rata yang dihasilkan menggunakan vitamin B5 mencapai 41.8 plb per botol setelah 6 mst sementara pada medium MS hanya 15 plb per botol Gambar 5. Komposisi vitamin B5 ternyata mengandung konsentrasi beberapa senyawa organik yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan komposisi vitamin MS. Perbandingan konsentrasi vitamin B5 Gamborg B-5 medium dengan vitamin MS adalah konsentrasi Nicotinic acid 2 x lebih tinggi. Thiamin- HCl 100 x lebih tinggi. dan Pyridoxine-HCl 20 x lebih tinggi. Kelebihan vitamin MS dibandingkan dengan vitamin B5 adalah mengandung asam amino Glycine dengan konsentrasi 2 ml L -1 sementara vitamin B5 tidak terdapat Glycine Gamborg 2002. Beberapa tanaman seperti wortel sangat membutuhkan asam amino sebagai sumber NH 2 nitrogen tereduksi yang berfungsi sebagai sumber nitrogen dan buffer yang mampu menjaga kestabilan pH medium terutama dalam menginduksi pembentukan embrio somatiknya Ramage dan Williams 2002, Dahleen dan Bregitzer 2002, namun untuk anggrek S. plicata ternyata ada atau tidaknya glycine tidak terlalu berpengaruh terhadap pertumbuhan dan multiplikasi plb. Konsentrasi gula di dalam medium tanam juga berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan dan multiplikasi plb anggrek S. plicata. Konsentrasi gula 30 g L -1 merupakan konsentrasi terbaik untuk multiplikasi plb karena mampu menghasil jumlah plb akhir tertinggi 25.1 plb per botol dan jumlah plb yang mampu berkembang menjadi planlet 8.7 planletbotol. peningkatan konsentrasi gula medium menyebabkan menurunnya pembentukan plb Gambar 5. Konsentrasi gula terlalu tinggi dapat menyebabkan medium menjadi terlalu pekat dan tekanan osmotik medium menjadi semakin tinggi. Akibatnya akan terjadi plasmolisis atau tertariknya air dari dalam sel keluar sel, selanjutnya akan terjadi pengkerutan dan pecahnya sel yang dapat menyebabkan terjadinya pencoklatan pada plb. Marlin 2005 juga melaporkan fenomena yang sama penelitian jahe dengan konsentrasi sukrosa tinggi. Peningkatan konsentrasi gula menjadi 40 g L -1 dapat memacu peningkatan tinggi planlet, karena pada tahap ini gula sangat dibutuhkan sebagai sumber energi dalam metabolisme sel. Kebutuhan energi diserap oleh planlet dari medium tanam selanjutnya akan dirombak dalam proses glikolis dan siklus kreb guna mendapatkan energi yang sangat dibutuhkan untuk pembelahan dan diferensiasi sel. Gula juga akan dirubah menjadi selulosa yang digunakan sebagai komponen utama penyusun dinding sel. Tanaman yang tumbuh di dalam botol kultur tidak melakukan fotosintesis oleh karena itu kebutuhan gula dipenuhi dari penyerapan langsung melalui medium tanam. Hasil uji lanjut menggunakan UJBD pada taraf α 5 pada perlakuan penambahan beberapa kombinasi jenis dan konsentrasi sitokinin 7 kombinasi perlakuan memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap jumlah plb, jumlah planlet dan tinggi tanaman pada umur 6 mst Tabel 6. Tabel 6. Pengaruh jenis dan konsentrasi sitokinin terhadap pertumbuhan dan perkembangan plb S. plicata pada 6 mst. Jenis dan konsentrasi sitokinin Jumlah plb plb botol Jumlah planlet plb eksplan Jumlah daun helai plt Jumlah akar Tinggi tanaman cm Kontroltanpa sitokinin 15.00 bc 2.40 bc 4.00 1.90 3.71 ab 20μM BA 19.60 ab 6.40 a 3.90 2.30 3.92 ab 40μM BA 13.60 c 2.80 bc 4.50 2.20 2.90 b 20μM Kinetin 16.80 b 1.50 c 4.40 1.40 4.72 a 40μM Kinetin 14.20 bc 3.70 bc 3.70 2.60 4.68 a 75 ml L -1 Air Kelapa 21.00 a 5.90 a 3.00 1.50 5.75 a 150 ml L -1 Air Kelapa 19.60 ab 2.70 bc 3.60 2.40 4.11 ab Keterangan : Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata pada UJBD dengan α = 0.05 Penambahan air kelapa 75 ml L -1 ke dalam medium MS sangat baik dalam menginduksi pertumbuhan dan multiplikasi plb, dengan kriteria jumlah plb akhir yang terbentuk sangat tinggi yaitu mencapai 21 plb per botol, jumlah plb yang berkembang membentuk planlet sebanyak 5.9 planlet per botol, jumlah akar 2.6 akarplanlet dan tinggi planlet yang terbentuk 4.72 cmplanlet. Jumlah plb akhir yang terbentuk tidak berbeda nyata dengan perlakuan peningkatan konsentrasi air kelapa menjadi 150 ml L -1 19.6 plb per botol sama dengan jumlah plb yang terbentuk pada medium MS dengan penambahan 20 μM BA 19.6 plb per botol setelah 6 mst Tabel 6. Respon pertumbuhan dan multiplikasi plb yang baik didapatkan dari penambahan air kelapa ke dalam medium MS. Diduga tanaman anggrek lebih menyukai sitokinin alami, karena komposisi air kelapa mengandung beberapa hormon tumbuh alami yang lebih kompleks dibandingkan dengan sitokinin sintetik seperti BA dan kinetin. Air kelapa disamping mengandung zeatin. dan dihydrozeatin juga terdapat diphenyl urea, gula dan beberapa senyawa organik lainnya yang sangat dibutuhkan oleh plb untuk multiplikasi plb maupun berkembang membentuk planlet Mederos-Molina 2004. Jumlah planlet tertinggi dihasilkan pada medium MS dengan penambahan BA 20 μM 6.4 planlet per botol dan medium MS dengan penambahan air kelapa 75 ml L -1 5.9 planlet per botol. Jumlah planlet yang dihasilkan 2-3 kali lipat dibandingkan dengan perlakuan lainnya dalam menginduksi perkembangan plb menjadi planlet Tabel 6. Perbedaan jenis dan konsentrasi sitokinin tidak berpengaruh nyata terhadap jumlah daun dan jumlah akar, karena rata-rata jumlah daun dan jumlah akar yang terbentuk sama dengan kontrol Tabel 6. Sitokinin berfungsi memacu pembelahan sel dan multiplikasi tunas bukan untuk perakaran. Sitokinin alami di dalam tumbuhan diproduksi pada meristem tip akar dan ditranslokasi secara acropetal menuju ujung pucuk, selanjutnya berfungsi dalam pembelahan sel pada meristem tip pucuk atau ujung batang Moore 1979. Penggunaan sitokinin lebih tepat bila arah dan tujuan penelitian adalah untuk multiplikasi tunas bukan ke arah induksi dan perkembangan perakaran. Penambahan air kelapa kedalam medium tanam dapat memacu perkembangan plb menjadi planlet dan tinggi tanaman dengan pengaruh yang sama baiknya dengan pemberian BA 20 μM. Perbedaan jenis dan konsentrasi sitokinin tidak berpengaruh nyata terhadap pembentukan akar dan daun. Pertumbuhan akar planlet sebaiknya menggunakan auksin saja. Keuntungan penambahan air kelapa kedalam medium tanam dapat memacu pertumbuhan dan perkembangan plb dan planlet, disamping itu air kelapa mudah didapat dan harganya murah, sehingga sangat menguntungkan untuk perbanyakan anggrek dalam skala komersial. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa penggunaan kinetin kurang baik untuk multiplikasi plb anggrek S. plicata karena jumlah akhir plb, planlet dan tinggi tanaman yang dihasil jauh lebih rendah dibandingkan dengan pemberian BA dan air kelapa. Penampilan visual hasil percobaan pengaruh penambahan beberapa jenis dan konsentrasi sitokinin ke dalam medium MS disajikan pada Gambar 7. Gambar 7. Pengaruh jenis dan konsentrasi sitokinin terhadap penampilan plb dan planlet pada 6 mst. S0 = tanpa sitokinin, Kin = kinetin, BA = BAP, AK = Air kelapa. Jumlah plb akhir, jumlah planlet dan warna daun yang hijau tua dengan beberapa akar yang kuat dihasilkan pada medium MS dengan penambahan air kelapa, sementara akar yang besar, kuat dengan bulu akar yang sangat banyak dihasilkan pada medium MS dengan penambahan BA. Planlet dengan kriteria yang demikian sangat dibutuhkan karena akan dapat beradaptasi dengan baik pada medium non aseptik setelah dilakukan aklimatisasi. Hasil penelitian ini sejalan dengan hasil penelitian Romeida dan Hidayanti 2005, mendapatkan multiplikasi plb dan planlet anggrek Dendrobium cv. Thampomas terbanyak pada medium MS dengan penambahan 3 ppm BAP, sedangkan multiplikasi plb dan planlet anggrek Dendrobium silangan cv. Thampomas x cv. Jaq. Hawaii di dapat pada media MS dan media Knudson C dengan penambahan 2 arang aktif dan 5 ppm BAP. Pembengkakan pangkal batang yang selanjutnya diikuti dengan keluarnya fenol dengan jumlah yang cukup banyak memenuhi permukaan medium dan medium berubah warna menjadi coklat kehitaman pada medium tanam hanya dijumpai pada perlakuan planlet yang ditanam pada medium MS + vitamin B5 + gula ditingkatkan menjadi 40 g L -1 dan penambahan 150 ml L -1 air kelapa. Planlet dengan kriteria yang seperti itu diduga akan dapat diarahkan untuk menginduksi pembungaan secara in vitro, karena ciri-ciri tunas yang demikian merupakan fase awal dari pembentukan bunga secara in vitro pada anggrek Dendrobium. Hasil penelitian Hee et al. 2009 pada anggrek Dendrobium cv. Chao Praya Smile, Tee et al. 2008 pada anggrek Dendrobium cv. Sonia, Sim et al. 2008 pada anggrek Dendrobium cv. Madame Thong-In sejalan dengan hasil penelitian ini. Ketiga peneliti tersebut melaporkan bahwa induksi pembungaan pada ketiga jenis anggrek Dendrobium yang berbeda memiliki ciri-ciri dan tahapan yang sama, yaitu diawali dengan pembengkakan pangkal batang, tidak terbentuk akar, selanjutnya terjadi bolting pemanjang ruas batang, muncul tangkai bunga influorescent dan terakhir akan terbentuk bunga fluorescent secara in vitro. Kesimpulan Berdasarkan hasil pengamatan terhadap karakter kualitatif dan kuantitatif pada 6 mst dapat diambil kesimpulan sebagai berikut : 1. Medium untuk pertumbuhan dan perkembangan biji dan multiplikasi plb anggrek S. plicata adalah medium MS + 50- 100 ml L -1 air kelapa dan medium VW + 50-100 ml L -1 air kelapa. 2. Perkembangan plb menjadi plantlet dan multiplikasi plantlet anggrek S. plicata yang terbaik dapat menggunakan medium MS vitamin B5 + 75 ml L -1 air kelapa atau menggunakan medium MS + BA 20 μM + 2 arang aktif dengan kriteria menghasilkan multiplikasi plb dan planlet tertinggi dan penampilan visual plb dan planlet yang prima pada hasil pengamatan pada 6 mst. Daftar Pustaka Ahmad TA, Abbasi NA, Hafiz IA, Ali A. 2007. Comparison of sucrose and sorbitol as main carbon energy sources in micropropagation of peach rootstock GF- 677. J. Bot. 394 : 1269-1275. Cribb PJ, Tang CZ. 1982. Spathoglottis Orchidaceae in Australia and the Pacific Islands. Kew Bulletin 364:721-729. Dahleen LS, Bregitzer P. 2002. An improved media system for high regeneration rates from barley immature embryo-derived callus cultures of commercial cultivars. Crop Science 42: 934 –938. Decruse SW, Gangaprsat A, Seeni S, Menon S. 2003. Microprogation and ecorestoration of Vanda spathulata, an exquisite orchidaceae. Plant Cell. Tissue and Organ Culture 72 : 199-202. [Direktorat Gizi Depkes RI]. 1996. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Bhratara. Jakarta. Gamborg OL. 2002. Plant tissue culture. Biotechnology. Milestones. In vitro Cellular and Developmental Biology Plant 38:84 –92. Gan S, Amasino RM. 1995. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science 270:1986-1988. Gunawan LW. 2001. Budidaya Anggrek. Penebar Swadaya. Jakarta. Handoyo F, Prasetya R. 2006. Native Orchids of Indonesia. Indonesian Orchid Society of Jakarta. PAI Jakarta. Hee KH, Loh CS, Yeoh HH. 2009. Early in vitro flowering and seed production in vitro culture in Dendrobium Chao Praya Smile Orchidaceae. Plant Cell Rep. 26 : 2055-2062. Kartikaningrum S, Effendie K, Soedjono S, Widiastoety D, Hayati NQ, Prasetyo W. 2004. Koleksi dan Karakterisasi plasma nutrfah anggrek Spathoglottis dan pemanfaatannya. In. Suhardi, Sutater T, Sulyo Y, Sabari, Maryam Eds.. Prosiding Seminar Nasional Florikultur 4-5 Agustus 2004. Balithi bekerjasama dengan Dirjen Tanaman Hias, Asbindo dan Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor. Kartikaningrum S, Puspasari D. 2005. Keragaman genetik plasma nutfah anggrek Spathoglottis . J. Hort 154:260-269. Kartikaningrum S, Sulyo Y, Hayati NQ, Suryanah, Bety YA. 2007. Keragaan karakter kualitatif hasil persilangan anggrek Spathoglottis. J Hort. Edisi Khusus 2: 138-147. Kenyo A, Murdaningsih HK, Herawati T, Darsa JS. 2002. Tanggap dua kultivar lili terhadap kombinasi komposisi medium MS dan gula pasir untuk konservasi in vitro . Zuriat 132 : 87-96. Kishor R, Devi HS, Jeyaram K, Singh MRK. 2008. Molecular characterization of resiprocal of Aerides vadaum and Vanda stangeana Orchidaceae at the protocorm stage. Plant Biotechnology Reports 22:145-152. Marlin. 2005. Pembentukan rimpang mikro jahe Zingiber officinale Rosc. secara in vitro dengan pemberian Benzyl Amino Purine dan sukrosa. Jurnal Akta Agrosia 82 : 70-73 Mederos-Molina S. 2004. In vitro callus induction and plants from stem and petiole explants of Salvia canariensis L. Plant Tissue Cult. 142 : 167-172 Mok MC. 1994. Cytokinin : chemistry, activity, and fuction. In. Mok M ed. Cytokinin and plant development an overview. p.155-156. CRC. Boca raton. Moore TC. 1979. Biochemistry and Physiology of Plant Hormones. Springer- Verlag New York. Murthy HN, Pyati AN. 2001. Micropropagation of Aerides maculosum Lindl. Orchidaceae. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 37 : 223-226. Minea M, Piluek C, Menakanit A, Tantiwiwat S. 2006. A Study on Seed Germination and Seedling Development of Spathoglottis Bl. Orchids. The Orchid Review MarchApril 2006. p65-71. Napoli CA, Beveridge CA, Snowden KC. 1999. Reevaluating concept of apical dominance and the control of axilarry bud outgrowth. Curr. Top. Dev. Biol. 44:127-169. Pierik RLM. 1987. In Vitro Culture in Higher Plants. Martinus Nijhoff. Dodrecht Nederland. Ramage CM. Williams RR. 2002. Mineral nutrition and plant morphogenesis. In vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 38: 116 –124. Ramirez-Parra E, Desvoyes B, Gutierrez C. 2005. Balance between cell division and differentiation during plant development. Int. J. Dev. Biol. 49:467-477. Romeida A. Yuliasari L. 2004. Stimulasi pertumbuhan anggrek silangan Vanda tricolor x Pteroceras palidum pada pemberian kinetin dan 2,4-D secara in vitro . Laporan penelitian tidak dipublikasi. Romeida A. Hidayanti T. 2005. Multiplikasi planlet anggrek Dendrobium cv. Thampomas x cv. Jaq. Hawaii pada beberapa taraf konsentrasi BAP dan Arang Aktif secara in vitro. Laporan penelitian tidak dipublikasi. Romeida A. 2008. Konservasi anggrek spesies endemik propinsi Bengkulu secara ex situ : Identifikasi anggrek spesies di Kabupaten Kepahiang Bengkulu. Laporan hasil penelitian Hibah Unggulan UNIB tahun anggaran 2007-2008. Seeni S, Latha PG. 1992. Foliar regeneration of endangered Red Vanda Renanthera imschootiana Rolfe Orchidaceae. Plant cell. Tissue and organ Culture 29 : 167-172. Seeni S, Latha PG. 2000. In vitro multiplication and ecorehabilitation endangered Blue Vanda. Plant cell. Tissue and organ Culture 61 : 1-8. Sim GE, Goh CJ, Loh CS. 2008. Induction of in vitro flowering in Dendrobium Madame Thong-In seedlings is associated with increase in endogenous N 6 - Δ 2 -isopentenyl-adenine iP dan N 6 - Δ 2 -isopentenyl-adenosine iPA. Plant Cell Rep 27:1281-1289. Talukdar BK, Ahmed MF. 2003. Spathoglottis plicata Blume: Specific cultivation. The Mc.Allen International Orchid Society Journal 101:4-6. Tee CS, Maziah M, Tan CS. 2008. Induction of in vitro flowering in the orchid Dendrobium cv. Sonia 17. Biologia Plantarm 524:723-726. Torres KC. 1989. Tissue Culture Techniques fos Horticultural Crops. An Avi Book. New York. 285p. Widiastoety D, Bahar F. 1995. Pengaruh berbagai sumber dan kadar karbohirat terhadap pertumbuhan planlet anggrek Dendrobium. Jurnal Hortikultura 53:76-80. Widiastoety D, Prasetyo W, Purbadi. 2004. Pengaruh bubur buah pisang terhadap pertumbuhan planlet anggrek Phalaenopsis dalam media kultur. Prosiding Seminar Nasional Florikultura. Bogor 4-5 Agustus pp.89 – 93. Winarno FG. 1993. Pangan, Gizi, Teknologi dan Konsumen. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

BAB V. INDUKSI MUTASI

PROTOCORM LIKE BODIES PLB ANGGREK Spathoglottis plicata Blume. AKSESI BENGKULU MENGGUNAKAN IRADIASI SINAR GAMMA DAN KARAKTERISASI MORFOLOGI SECARA IN VITRO INDUCED MUTATION OF PROTOCORM LIKE BODIES PLB OF Spathoglottis plicata Blume. ORCHID ACCESSION BENGKULU THROUGH GAMMA IRADIATION AND MORPHOLOGICAL CHARACTERIZATION OF IN VITRO CULTURES Abstract Spathoglottis plicata Blume is one type of orchids with low level of genetic diversity, especially in flower color compared to the other ochids. The experiment aimed 1 to induce the genetic diversity of S. plicata accession Bengkulu using gamma irradiation to the protocorm like bodies plbs, 2 to determine a lethal dose 50 LD 50 of plbs through gamma irradiation, and 3 to identify the genetic variability of S. plicata mutants base on morphological characters of vegetative growth phase during in vitro culture. The experiment used Completely Randomized Design with 11 doses gamma irradiation 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, and 100 Gy. The result revealed that the increase of genetic variability of orchid plbs after gamma-ray irradiation treatment with doses ranged 30-70 Gy. The LD 50 of percentage of plb survival was 47.71 Gy, seven months after gamma irradiated. The LD 50 of percentage of new plb formation was 34.40 Gy. There were some color changes of plbs produced after gamma irradiation, which were bright purple, albino and chimeric plbs. Beside, the diversity was also produced of plantlets such as variegated green leaves, curly leaves, spiral shaped leaves, variegated purple leaves and albino leaves planlets. Keywords : Spathoglottis plicata, orchid, mutant, gamma irradiation, variegation, protocorm like bodies Pendahuluan Keragaman genetik anggrek Spathoglottis sp. sangat rendah dibandingkan dengan jenis anggrek lain, khususnya untuk bentuk dan warna bunga. Upaya peningkatan keragaman genetik secara konvensional menggunakan teknik persilangan sudah dilakukan oleh Balithi, namun sampai saat ini baru tiga varitas baru yang sudah dilepas oleh menteri pertanian. Kartikaningrum et al. 2007. Ketiga varietas yang sudah dilepas tersebut masih menjadi koleksi Balithi Segunung dan tanamannya belum bisa didapat pada berbagai tempat penjualan anggrek besar di Indonesia seperti di Taman Anggrek Taman Mini Indonesia Indah maupun di Taman Anggrek Ragunan. Upaya lain untuk meningkatkan keragaman genetik dapat menggunakan iradiasi sinar gamma van Harten 2002. Metode mutagenesis merupakan metode cepat yang dapat menghasilkan mutan-mutan yang memiliki keunggulan tertentu. Penggunaan mutagen sinar gamma akan lebih efektif bila menggunakan materi yang tepat, misalnya kalus, planlet, biji, umbi, stek, dan bahan perbanyakan lainnya. Iradiasi pada kalus yang banyak digunakan untuk menciptakan keragaman genetik sudah banyak dilaporkan oleh beberapa peneliti diantaranya adalah iradiasi sinar gamma pada plb dan planlet anggrek Dendrobium cv. Sonia Sheela et al. 2006. Senevere dan Wijessundara 2007 juga melaporkan keberhasilan induksi mutasi kalus tanaman Firts African Violet Saintpaulia ionanth dan telah berhasil mendapatkan mutan warna bunga stabil yang berbeda dibandingkan dengan tipe liarnya. Mutan stabil hasil iradiasi kalus dan tunas mikro pada beberapa jenis tanaman sudah banyak dihasilkan melalui induksi mutasi fisik menggunakan sinar gamma, seperti yang dilaporkan oleh Seneviratne et al. 2002 pada tanaman Didymocarpus humboldtianus dan pada tanaman Crysanthemum Datta et al. 2005. Tanaman mandul jantan serta perubahan warna dan bentuk petal dihasilkan setelah dilakukan iradiasi sinar gamma pada umbi tanaman Cyclamen menggunakan dosis 8-16 Gy Sugiyama et al. 2008. Menurut Aly 2010, mutan Eryngium foetidum L. didapat setelah dilakukan iradiasi dengan dosis antara 0-40 Gy. Peningkatan konsentrasi senyawa fenol dihasilkan pada dosis 40 Gy, konsentrasi flavonol menurun seiring dengan bertambahnya dosis iradiasi, konsentrasi vitamin C, thiamine , riboflavin dan asam nikotinat bertambah pada dosis iradiasi 10 Gy, demikian pula dengan konsentrasi asam folat, terjadi peningkatan pada konsentrasi 20-40 Gy. Pendeteksian awal terjadinya mutasi antara lain dapat dilakukan menggunakan penanda morfologi seperti perubahan warna, bentuk dan ukuran dari bahan yang iradiasi Ismachin 2007. Penanda morfologi umumnya ditujukan pada karakter kualitatif seperti karakter bentuk dan warna akar, batang, daun, bunga, buah, dan biji. Karakter kualitatif dikendalikan oleh gen sederhana satu atau dua gen dan sedikit dipengaruhi oleh lingkungan Talhinhas et al. 2006. Perbedaan karakter morfologi pada organ akar, batang dan daun dapat diamati dengan membandingkannya dengan tanaman kontrol sebagai pembanding Tjitrosoepomo 2005. Pengamatan mutan hasil iradiasi pada karakter morfologi secara in vitro juga sering dilakukan sebagai deteksi dini terjadinya mutan. Pengamatan karakter in vitro yang diamati pada kultur ray floret Chrisanthemum yang sudah diradiasi selanjutnya di tumbuhkan pada medium in vitro antara lain adalah persentase pertumbuhan ray floret membentuk kalus dan perkembangannya membentuk embrio, semua perubahan bentuk dan warna kalus maupun planlet diamati secara visual. Perbedaan pada fase kalus umumnya akan berkembang membentuk planlet yang berbeda dengan tipe liarnya. Warna dan bentuk bunga diamati setelah semua planlet hasil iradiasi di aklimatisasi baik yang berbeda karakter vegetatif in vitro maupun tidak Datta et al. 2005 Percobaan ini bertujuan untuk menginduksi keragaman genetik anggrek S. plicata aksesi Bengkulu menggunakan iradiasi sinar gamma pada protocorm like bodies plb, menentukan radiosensitivitas plb menggunakan kriteria lethal dosis 50 LD 50 dan mengidentifikasi keragaman genetik mutan anggrek S. plicata berdasarkan karakter morfologi fase vegetatif secara in vitro. Bahan dan metode Waktu dan Tempat Percobaan ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian IPB, dari bulan Oktober 2008 hingga Februari 2012. Bulan Oktober 2008-Juni 2009 dilakukan produksi liniklon, bulan Juni dilakukan iradisi sinar gamma di PATIR Batan Jakarta menggunakan bahan iradiasi lini klon plb anggrek S. plicata. Bulan Juni 2010 sampai Februari 2012 dilakukan pemeliharan dan pengamatan plb yang telah diradiasi. Metode Percobaan Bahan iradiasi yang digunakan adalah lini klon plb anggrek S. plicata yang berumur 6 minggu setelah sub kultur yang keempat, menggunakan medium MS padat dengan penambahan air kelapa sebanyak 75 ml L -1 . Setiap botol dipilih plb yang seragam pertumbuhannya sebanyak 25 plb per botol. Botol yang berisi plb selanjutnya diradiasi akut menggunakan alat Irradiator Gamma Chamber 4000A. Laju dosis saat pelaksanaan iradiasi adalah 87.6790 kradjam dan aktivitas cobalt-60 di dalam iradiator pada bulan Juni 2010 adalah 10029.4965 ci. Perhitungan waktu penyinaran bahan iradiasi di dalam gamma chamber menggunakan rumus : Waktu penyinaran = � � �� � � �−�� ........dikonversi ke menit dan detik Percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Perlakuannya adalah 11 taraf dosis iradiasi sinar gamma yang terdiri dari : D0 kontrol tanpa diradiasi, D1 = 10 Gy 0 41, D2 = 20 Gy 1 22, D3 = 30 Gy 2 03, D4 = 40 Gy 2 45, D5 = 50 Gy 3 59, D6 = 60 Gy 4 07, D7 = 70 Gy 4 48, D8 = 80 Gy 5 29, D9 = 90 Gy 6 10, D10 = 100 Gy 6 52. Setiap dosis perlakuan diulang sebanyak 10 kali atau sebanyak 10 botol yang setara dengan 250 plb, sehingga total plb yang diradiasi adalah sebanyak 2 500 plb. Setelah diradiasi plb disub kultur ke medium MS padat dengan penambahan 75 ml L -1 air kelapa berselang seling dengan medium MS dengan penambahan BA 20 μM dan 2 arang aktif dan dikarakterisasi secara in vitro . Skema bagan alir penelitian disajikan pada Gambar 8. Lini klon plb S. plicata Sub Kultur I Sub Kultur II Sub Kultur III PLB dan Plantlet Mutan Data kualitatif Iradiasi sinar gamma 11 dosis 0 Gy,10 Gy, 20 Gy, 30 Gy, 40 Gy, 50 Gy, 60 Gy, 70 Gy, 80 Gy, 90 Gy, 100 Gy Data kuantitatif Ditampilkan dalam bentuk foto Uji F 5 UJBD 5 Best Curve Fit Analysis Gambar 8. Skema bagan alir penelitian induksi mutasi dengan iradiasi sinar gamma pada plb anggrek S. plicata Pengamatan dilakukan setiap minggu untuk persentase plb hidup, persentase plb mati, dan jumlah plb baru. Sub kultur dilakukan setiap 8 minggu dengan tujuan supaya plb dapat tumbuh baik pada medium yang selalu segar. Pengamatan yang dilakukan pada akhir penelitian terhadap persentase plb hidup, persentase plb mati, persentase plb baru, persentase populasi akhir, dan tinggi planlet. Data kuantitatif hasil pengamatan dianalisis menggunakan Uji F pada taraf α 5, bila terdapat pengaruh nyata dianjutkan denga n Uji Jarak Berganda Duncan’s UJBD pada taraf α 5. Data persentase plb hidup, persentase plb mati, persentase populasi akhir, dan persentase plb baru dianalisis menggunakan Best Curve Fit Analy sis untuk mendapatkan model kurva dan nilai LD 50 Finney dan Philip 2005, Findlay dan Dillard 2007. Hasil dan Pembahasan Hasil uji F terhadap semua data kuantitatif pada 7 bulan setelah diradiasi bsi menunjukkan bahwa terdapat pengaruh yang berbeda nyata terhadap semua peubah kuantitatif yang diuji yaitu jumlah plb akhir, jumlah plb baru dan tinggi planlet. Pertumbuhan plb anggrek S. plicata tanpa diradiasi sinar gamma dijadikan kontrol pembanding pertumbuhan dan perkembangan plb yang diradiasi dengan sebelas taraf dosis iradiasi sinar gamma. Persentase plb hidup pada tanaman kontrol mencapai 99.21 pada 7 bsi dengan jumlah plb akhir mencapai tiga kali lipat. Perlakuan iradiasi sinar gamma dengan dosis 10 – 100 Gy terlihat adanya pengaruh yang sangat signifikan terhadap pertumbuhan dan multiplikasi plb. Semakin tinggi dosis iradiasi sinar gamma, kemampuan hidup plb, pembentukan plb baru, jumlah populasi akhir dan tinggi tanaman semakin rendah. Semakin tinggi dosis iradiasi, pemulihan kerusakan sel akibat paparan dosis sinar gamma juga semakin lama. Jumlah plb anggrek S. plicata yang hidup terus menurun sampai bulan keenam, mulai pada 7 bsi kondisi plb sudah mulai pulih, dapat tumbuh dengan stabil dan mulai terjadi multiplikasi plb. Pertumbuhan dan multiplikasi plb anggrek S. plicata terbaik dapat diketahui dari hasil uji lanjut menggunakan UJBD pada taraf α 5 terhadap semua peubah yang berbeda nyata Tabel 7. Plb hanya mampu bertahan hidup sampai dengan dosis sinar gamma 70 Gy. Peningkatan dosis paparan yang lebih tinggi 80-100 Gy semua plb tidak ada yang mampu bertahan hidup. Plb yang diradiasi sinar gamma 80-90 Gy hanya mampu bertahan hidup sampai umur 2 bulan saja, dengan persentase yang sangat rendah yaitu sekitar 2-3.4. Plb yang diradiasi sinar gamma 100 hanya mampu bertahan hidup selama 1 bulan, dengan persentase plb hidup 4.8, pada 7 bsi semua plb menghitam dan tidak yang mampu tumbuh kembali. Kematian plb dapat diamati mulai dari 2 minggu setelah diradiasi, terutama untuk plb yang diradiasi dengan dosis tinggi. Gejala kematian dimulai dengan menguningnya plb, selanjutnya plb menjadi coklat dan menghitam. Massa plb terlihat berwarna hitam sebagai tanda terjadi kematian sel akibat iradiasi sinar gamma. Bila kerusakan sel sangat besar maka plb tidak mampu melakukan pemulihan dan bertahan hidup, sementara untuk sel-sel yang mampu memulihkan diri akan membelah dan berkembang menjadi plb baru. Sebagian sel-sel telah mengalami perubahan akibat iradiasi selanjutnya akan berkembang menjadi tanaman mutan. Bila hanya sebagian sel saja yang berubah maka akan terbentuk jaringan maupun organ kimera. Tabel 7. Pengaruh sebelas dosis iradiasi sinar gamma terhadap pertumbuhan dan perkembangan plb pada 7 bsi. Dosis Gy Jumlah plb awal Jumlah plb akhir Jumlah planlet akhir Tinggi Planlet cm plb hidup plb mati 251 699 a 449 a 7.40 a 99.21 0.79 10 254 496 b 246 b 8.90 a 98.45 1.55 20 260 179 c 55 d 6.40 a 83.97 16.03 30 254 146 c 101 c 5.60 ab 89.60 10.40 40 252 153 d 31 e 5.40 ab 53.17 46.83 50 253 73 d 31 e 4.90 ab 42.97 57.03 60 252 49 d 20 e 3.00 bc 48.41 51.59 70 251 4 e 4 f 2.60 c 1.57 98.43 80 257 f g d 100 90 253 f g d 100 100 251 f g d 100 Keterangan : Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata pada UJBD pada taraf α = 0.05. Fenomena yang berbeda untuk jumlah plb yang mampu bertahan hidup terlihat pada dosis rendah. Plb yang diradiasi dengan dosis 10 Gy terlihat mengalami gejala klorosis bahkan nekrosis pada beberapa bagian jaringan plb. Kematian plb terus meningkat sampai bulan ketiga setelah diradiasi, namun sebagian plb mampu bertahan hidup dan pada bulan keempat plb mampu bermultiplikasi membentuk plb baru sehingga pada bulan ketujuh jumlah plb yang terbentuk mencapai dua kali lipat dibandingkan dengan jumlah plb awal. Sementara plb yang dipaparkan dengan dosis yang lebih tinggi 20-30 Gy, kematian plb terus terjadi sampai bulan keenam, namun persentasenya belum mencapai 50. Plb mulai pulih pada bulan keenam dan mulai bermultiplikasi pada bulan ketujuh. Jumlah plb hidup setelah diradiasi dengan dosis 40-70 Gy juga menunjukkan fenomena yang sama, namun kematian plb sampai dengan bulan keenam setelah diradiasi lebih dari 50. Pemulihan plb juga mulai terlihat mulai dari bulan keenam setelah diradiasi. Bukti terjadinya pemulihan antara lain adalah terbentuknya plb baru dan berkembangnya plb menjadi planlet. Kurva jumlah plb hidup 1-7 bsi disajikan pada Gambar 9. Gambar 9. Kurva jumlah plb anggrek S. plicata yang hidup pada 1-7 bsi dengan 11 taraf dosis iradiasi sinar gamma. Pembentukan plb baru sangat penting untuk memperbanyak plb terutama plb mutan hasil iradiasi. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan plb setelah diradiasi, antara lain tingkat kerusakan sel yang terjadi tidak terlalu besar, sehingga plb dapat melakukan regenerasi sel-selnya membentuk sel-sel yang baru dan terus berkembang membentuk massa sel yang selanjutnya akan berkembang menjadi plb baru Kim et al. 2003. Selain itu media pendukung pertumbuhan plb harus sesuai dengan kebutuhan plb, sehingga mampu memenuhi kebutuhan plb untuk terus tumbuh dan berkembang Martin et al. 2003. Media tumbuh harus mengandung nutrisi dan zat pengatur tumbuh dengan komposisi yang sesuai dengan kebutuhan bahan eksplan yang ditanam Dewir et al. 2007. Pertumbuhan terbaik tunas krisan setelah diradiasi terjadi pada medium MS dengan penambahan 10 mg L - 1 BA Datta et al. 2005. Multiplikasi plb anggrek S. plicata menggunakan medium 50 100 150 200 250 300 1 2 3 4 5 6 7 p lb h idu p Bulan setelah iradiasi 0 Gy 10 Gy 20 Gy 30 Gy 40 Gy 50 Gy 60 Gy 70 Gy 80 Gy 90 Gy 100 Gy MS dengan penambahan 75 ml L -1 air kelapa serta pada medium MS dengan penambahan 20 μM BA dengan kriteria jumlah plb akhir dan jumlah planlet akhir tertinggi, jumlah akar terbanyak dan tinggi tanaman tertinggi serta penampilan visual yang sangat prima Romeida 2011. Pemulihan plb terjadi pada bulan keenam dan sudah tidak ada lagi plb yang mati pada bulan ketujuh. Oleh karena itu, maka pengambilan data untuk dianalisis menggunakan Best Curve fit analysis untuk plb anggrek S. plicata sebaiknya dilakukan pada bulan keenam atau ketujuh. Gambar 10. Kurva hubungan dosis iradiasi sinar gamma dengan a persentase plb hidup, b persentase plb mati, c persentase plb akhir, d persentase populasi akhir anggrek S. plicata pada 7 bsi. Hasil analisis data menggunakan Best curve fit analysis terhadap pertumbuhan vegetatif plb pada bulan ketujuh setelah diradiasi, didapatkan bahwa persentase plb hidup menghasilkan model kurva Polynomial Fit y = 98.32 + 0.36x - 0.043x 2 + 0.0003x 3 .... , LD 30 = 35.69 Gy, LD 50 = 47.71 Gy, dan LD 70 = 59.58 Gy. Persentase plb mati menghasilkan model kurva Gaussian Model y=10.31exp-89.88- x2233.642, LD 30 = 36.94 Gy, LD 50 = 49.33 Gy, dan LD 70 = 60.20 Gy. Persentase plb baru menghasilkan model kurva Polynomial Fit y = 34.826 – 15.758x + 0.224x 2 – 0.001 x 3 ..... , LD 30 = 29.95 Gy, LD 50 = 34.40 Gy dan LD 70 = 43.20 Gy. Persentase populasi akhir pada bulan ketujuh setelah plb diradiasi menghasilkan model kurva Quadratic Fit y=4.058 – 11.27x + 0.073x2, LD 30 = 43.20 Gy, LD 50 = 47.52 Gy, dan LD 70 = 52.57 Gy. Hasil penelitian ini mendapatkan bahwa LD 50 untuk masing-masing peubah plb anggrek S. plicata berbeda-beda, berkisar antara 34.40 Gy – 49.33 Gy Gambar 10. Beberapa hasil penelitian induksi mutasi dengan iradiasi sinar gamma telah menghasilkan mutan terbanyak pada dosis iradiasi sekitar LD 50 . Aisyah et al. 2009, melaporkan bahwa LD 50 untuk stek pucuk anyelir yang diradiasi dengan sinar gamma berkisar antara 49-72 Gy. Mutasi fisik dengan iradiasi sinar gamma telah mampu menciptakan 106 mutan dari 5 nomor anyelir. Herison et al. 2008, mendapatkan LD 50 beberapa galur jagung hasil iradiasi sinar gamma berkisar antara 97-424 Gy, tergantung dari sensitivitas galur yang diradiasi. Induksi mutasi dengan sinar gamma pada Thai Tulip Curcuma alismatifolia mendapatkan LD 50 pada dosis sekitar 25 Gy, pada dosis tersebut terjadi perubahan perkembangan bunga, mutasi klorofil dan alterasi morfologi tanaman sehingga menghasilkan beberapa mutan Abdullah et al. 2009. Lamseejan et al. 2000, melaporkan bahwa dosis iradiasi sinar gamma yang optimum menghasilkan mutan yang diinginkan pada krisan klon ungu berada pada kisaran 19.5-22 gray, dengan nilai LD 50 sekitar 14 Gy. Hasil seleksi secara in vitro pada plb yang sudah diradiasi pada sebelas taraf dosis iradiasi sinar gamma menunjukkan bahwa terdapat beberapa perbedaan morfologi pada beberapa fase pertumbuhan plb dan pada beberapa bagian plb dan planlet hasil perkembangan dari plb yang telah diradiasi. Perubahan yang teramati antara lain terbentuknya plb variegata pada dosis 40-60 Gy. Plb albino banyak ditemukan pada plb yang telah diradiasi dengan dosis 60-70 Gy. Fenomena plb variegata maupun albino disebabkan oleh karena sel kehilangan kemampuan pembentukan klorofil pada sebagian maupun semua bagian sel yang terpapar sinar gamma. Selain itu, juga ditemukan plb yang berwarna ungu pada dosis 30 Gy. Pengaruh negatif akibat iradiasi terhadap plb juga terbentuknya kalus kompak yang tidak terkendali. Kalus kompak tersebut setelah dibelah dan disub kultur tetap tumbuh menjadi kalus kompak yang tidak terkendali, sampai dua kali sub kultur kalus kompak tersebut belum menunjukkan perkembangannya menjadi organ tanaman Gambar 11. Gambar 11. Pertumbuhan dan perkembangan plb pada 7 bsi : a. plb normal 0-10 Gy, b. multiplikasi plb tinggi 20 Gy, c. Kimera plb variegata dan plb ungu 30 Gy, d. plb membentuk kalus dan pembentukan planlet kimera 50 Gy, e. planlet albino 70 Gy, f. plb berkembang menjadi kalus kompak 60 Gy, g. plb ungu dan variegata 40 Gy, h. pertumbuhan plb kimera menjadi plb normal, ungu, albino 40 Gy Bar 1 mm. Hasil pengamatan pertumbuhan plb yang diradiasi dengan dosis 50 Gy dan 60 Gy juga teridentifikasi adanya kimera. Pertumbuhan dari satu plb selanjutnya berkembang membentuk dua plb yang berbeda warnanya, yang satu berwarna ungu cerah dan yang lain membentuk plb variegata. Multiplikasi plb warna ungu akan tetap ungu, sementara pertumbuhan plb yang variegata selanjutnya dapat berkembang menjadi plb normal, plb variegata dan plb albino Gambar 11. Perubahan yang teramati setelah plb berkembang menjadi planlet antara lain terbentuknya daun variegata, daun albino, daun melintir seperti spiral dan