ANALISIS KERAGAMAN GENETIK ANGGREK

Tabel 14. Rekapitulasi karakter morfologi mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya. No Karakter morfologi sub karakter morfologi Jumlah sub karakter Jumlah karakter polimorfik Jumlah karakter monomorfik 1. Tipe pertumbuhan simpodial 1 1 2. Ukuran tanaman kecil 50 cm, sedang 50-100 cm, besar 100 cm 3 3 3. Bentuk penampang bujur kormus eliptic, sircular 2 2 4. Bentuk penampang melintang kormus circular 1 1 5. Ukuran kormus kecil 2 cm, sedang 2-3 cm, besar 2 cm 3 3 6. Tipe pertumbuhan anakan pada kormus 2 arah 1 1 7. Tipe pertumbuhan daun pada kormus 2 arah 1 1 8. Tipe pertumbuhan tangkai bunga pada kormus pada pangkalsisi pseudobulb , ujung terminal 2 2 9. Ketegakan kormus tegak, semi tegak 2 2 10. Warna kormus hijau, hijau kecoklatan, hijau keunguan 3 3 11. Jumlah anakan per kormus 1=sedikit, 2 =sedang, 2 bangak 3 3 12. Warna ujung akar 1cm dari ujung akar putih, kuning 2 2 13. Warna pangkal akar ungu tua, ungu cerah, putih 3 3 14. Irisan melintang akar ungu, kuning, putih 3 3 15. Bulu akar ada 1 1 16. Penampang melintang daun plicate 1 1 17. Daun muda variegata putih kekuningan, normal 2 2 18. Warna daun tua hijau tua, hijau tua variegata, hijau kekuningan 3 3 19. Warna batang semutangkai daun ungu, hijau 2 2 20. Bentuk daun lonjong lebar, lonjong membulat , lonjong sempit 3 3 21. Bentuk ujung daun apiculate 1 1 No Karakter morfologi sub karakter morfologi Jumlah sub karakter Jumlah karakter polimorfik Jumlah karakter monomorfik 22. Ujung daun simetris 1 1 23. Bentuk tepi daun sinulateberliuk, rata 2 2 24. Ujung daun menjuntai, tegak 2 2 25. Ukuran daun panjang, sedang, pendek 3 3 26. Tulang daun sejajar sampai pangkal batang sejajar 1 1 27. Warna tunas hijau, hijau keunguan, ungu cerah 3 3 28. Warna tangkai bunga hijau keunguan, ungucerah, hijau 3 3 29. Tekstur permukaan daun gundulglabraus 1 1 30. Tipe pembungaan racemoseracemetandan 1 1 31. Resupinasi putik ada 1 1 32. Resupinasi bunga setelah mekar ada 1 1 33. Perhiasan bunga terdiri dari 3 sepal 2 petal 1 1 34. Sepal lateral normal, bersatu sampai bunga mekar dua hari 2 2 35. Bentuk bunga semi bulat, bintang 2 2 36. Bentuk sepal dorsal dan lateral spatulate, oblong 2 2 37. Bentuk petal elliptic datar, bergelombang 2 2 38. Bentuk ujung sepal dan petal acute menajam keujung 1 1 39. Penampang melintang sepal dan petal datar, convexrecunving cekung 2 2 40. Bentuk kelopak tangkai bunga hati, ellips 2 2 41. Ukuran kelopak tangkai bunga kecil, sedang, besar 3 3 42. Jumlah tangkai bunga tumbuh bersamaan per kormus 1, 2, 2 3 3 43. Jumlah bunga mekar bersamaan 3bunga, =3bunga, 3bunga 3 3 No Karakter morfologi sub karakter morfologi Jumlah sub karakter Jumlah karakter polimorfik Jumlah karakter monomorfik 44. Tipe tonjolan callus pada bibir complex 1 1 45. Spurtaji ada 1 1 46. Jumlah polinia 8 1 1 47. Warna mahkota bunga ungu cerah, pink cerah, pink muda, pink sangat muda medekati putih, kuning cerah, kuning muda, putih 7 7 48. Warna sepal dorsal dan lateral ungu cerah, pink cerah, pink muda, pink sangat muda mendekati putih, kuning cerah, kuning muda, putih 7 7 49. Warna bunga polos, gradasi pink cerah kuning muda, bintik pink cerah pink sangat muda, pink muda sepal ungu cerah petal 4 4 50. Warna bunga 1 warna, 2 warna 2 2 51. Warna keping sisiside lobelateral lobe ungu cerah, merah, kuning, putih, pink muda, pink sangat muda 6 6 52. Warna side lobe 1warna, 2 warna 2 2 53. Warna keping tengahmid lobe apical lobe ungu cerah, pink kemerahan, pink muda keunguan, pink fanta, kuning cerah, pink, pink keunguan, putih 8 8 54. Warna kalustonjolan pada bibir kuning cerah, kuning muda, pink sangat muda bintik ungu, kuning cerah bintik merah, kuning cerah bintik ungu cerah 5 5 55. Warna kalus 1 warna, 2 warna 2 2 56. Warna coulomb merah, pink muda, ungu cerah, pink tua, kuning cerah, putih 6 6 57. Warna taji kuning cerah, kuning muda, putih 3 3 58. Mahkota dan sepal saat bunga mekar tidak terbuka lebar, terbuka lebar 2 2 59. Warna bakal buah ungu tua, ungu kehijauan, hijau keunguan, hijau 4 4 No Karakter morfologi sub karakter morfologi Jumlah sub karakter Jumlah karakter polimorfik Jumlah karakter monomorfik 60. Warna tangkai bunga ungu cerah, ungu kehijauan, pink keunguan, ungu kecoklatan, hijau, hijau kekuningan 6 6 61. Warna buah tua hijau tua, hijau kekuningan, hijau kecoklatan, hijau keunguan 4 4 62. Bentuk bunga bintang, bintang membulat 2 2 63. Bentuk petal cekung pinggir rata, cekung pinggir bergelombang 2 2 64. Bentuk petal eliptic 1 1 65. Bentuk sepal dorsal eliptic, ovate 2 2 66. Bentuk apical lobe obovate, deltoid, obovate transverse 3 3 67. Ukuran apical lobe medium, shallow 2 2 68. Bentuk apical lobe datar, melengkung keatas, melengkung kebawah 3 3 69. Ukuran bunga kecil diameter 4 cm, sedang diameter 4 cm, besar diameter 4 cm 3 3 70. Lama mekar bunga bersamaan 3hari, 3-4 hari, 4hari 3 3 Jumlah Sub karakter 177 158 19 Persentase sub karakter 100 89.27 12.03 Total hasil pengamatan jumlah sub karakter yang dapat diamati adalah 177 sub karakter, yang terdiri dari 158 sub karakter bersifat polimorfik dan 19 sub karakter bersifat monomorfik. Polimorfisme pola pita yang dihasilkan dari 70 karakter morfologi menunjukkan keberagaman sub karakter yang sangat tinggi hingga mencapai 89.27, sementara pola pita monomorfik hanya mencapai 12.03. Karakter morfologi yang bersifat monomorfik sebanyak 19 karakter merupakan penciri utama dari anggrek S. plicata dan tidak mengalami perubahan walaupun sudah diradiasi dengan sinar gamma sampai dengan dosis 100 Gy adalah tipe pertumbuhan tanaman simpodial, bentuk penampang melintang kormus circular, tipe pertumbuhan anakan pada kormus 2 arah, tipe pertumbuhan daun pada kormus berselang seling 2 arah, bentuk ujung daun apiculate, ujung daun simetris, bulu akar ada, penampang melintang daun plicate, tulang daun sejajar sampai pangkal batang sejajar, tekstur permukaan daun gundulglabraus, tipe pembungaan racemoce raceme tandan, resupinasi putik ada, resupinasi bunga setelah mekar ada, perhiasan bunga terdiri dari 2 petal dan 3 sepal, bentuk ujung sepal dan petal acutemenajam keujung, tipe tonjolan callus pada bibir kompleks, spurtaji ada, jumlah polinia 8 buah, bentuk petal elliptic. Mutasi induksi menggunakan iradiasi sinar gamma 30-100 Gy, telah mampu merubah sebagian besar 89.27 karakter morfologi tanaman tipe liarnya atau terjadi perubahan 51 karakter vegetatif dan karakter generatif tanaman mutan. Analisis Kluster Berdasarkan Karakter Morfolologi Analisis kluster diperlukan untuk mengevaluasi keragaman karaktersub karalter morfologi sehingga dapat diketahui kedekatan hubungan antar tanaman mutan, antar tanaman pembanding dan antara tanaman mutan dengan pembandingnya. Marka morfologi walaupun dipengaruhi oleh lingkungan, namun keberagaman morfologi sangat penting karena langsung dapat diamati perbedaan fenotifik yang terjadi pada tanaman setelah diiradiasi. Karakter morfologi yang umum diamati pada tanaman untuk karakter kualitatif, adalah bentuk dan warna organ tanaman, karena biasanya dikendalikan oleh gen tunggal. Mutasi yang terjadi pada gen tunggal yang membawa sifat bentuk dan warna, baik pada daun maupun pada bunga akan langsung terekspresi sampai pada karakter fenotipenya, dan langsung terlihat terjadinya perubahan bentuk dan warna daun maupun bunga yang mengalami mutasi. Berdasarkan hasil analisis data biner skor sub karakter morfologi tanaman menggunakan program NTSYS, diperoleh 5 kelompok tanaman pada koefisien kemiripan 0.68. Kelompok 1 terdiri atas tanaman anggrek spesies S. plicata SpBA wildtype, SpBH dan S04. Kelompok 2 terdiri atas mutan 7, mutan 8 dan mutan 9. Kelompok 3 terdiri atas mutan 3. Kelompok 4 terdiri atas mutan 1, mutan 4, mutan 2. Kelompok 5 terdiri atas mutan 5 dan mutan 6, kedua mutan ini belum mampu diinduksi pembungaannya sampai dengan 28 bulan setelah diradiasi dengan sinar gamma. Koefisien kemiripan morfologi berkisar antara 0.41 – 0.83 Gambar 29 dan Lampiran 1. Gambar 29. Dendrogram analisis kluster berdasarkan karakter morfologi pada mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya. Berdasarkan dendrogram analisis terhadap 70 karakter morfologi didapatkan bahwa koefisien kemiripan antara kelompok 1 dengan kelompok 2 adalah sebesar 0.61. Koefisien kemiripan antara kelompok 1 dan 2 dengan kelompok 3 sebesar 0.58. Koefisien kemiripan antara kelompok 1, 2 dan 3 dengan kelompok 4 sebesar 0.56. Koefisien kemiripan kelompok 1, 2, 3 dan 4 dengan kelompok 5 sebesar 0.41. Matrik jarak Euclidian antara anggrek S. plicata dengan mutannya berdasarkan hasil analisis 70 karakter morfologi menghasilkan koefisien kemiripan yang berkisar antara 0.41- 0.83. Koefisien kemiripan yang rendah dihasilkan oleh kelompok 5 yaitu mutan 5 100 Gy dan mutan 6 50 Gy, diduga karena tanaman ini belum berbunga sehingga belum dapat dibandingkan dengan tanaman anggrek S. plicata tipe liarnya dan tanaman mutan lain yang sudah berbunga Gambar 29. Nilai goodness of fit matrik korelasi r penanda morfologi mencapai 0.89 dapat dikatagorikan menjadi kriteria sesuai, sejalan dengan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Wang et al. 2009, yang menyatakan bahwa tingkat keselarasan pengelompokan ditentukan oleh nilai goodness of fit yaitu kesesuaian antara nilai koefisien kemiripan SM dengan kriteria sangat sesuai r 0.9, sesuai 0.8 r 0.9, tidak sesuai 0.7 r 0.8 dan sangat tidak sesuai r 0.7. Analisis komponen utama Karakter morfologi yang menentukan terbentuknya pengelompokan dapat dianalisis menggunakan nilai Analisis Komponen Utama AKUPCA. Pengelompokan aksesi yang memiliki kemiripan berdasarkan karakter morfologi disajikan menggunakan gambar dua dimensi melalui pengukuran analisis komponen utama. Data karakter yang dapat digambarkan melalui 5 komponen utama hanya sebesar 70 dari keseluruhan data, sedangkan pengelompokan berdasarkan 100 data dapat dilihat pada hasil analisis pengelompokan menggunakan program NTSYS. Adapun nilai masing-masing komponen utama disajikan pada Tabel 15 dan gambar dua dimensi hasil analisis berdasarkan komponen utama dapat dilihat pada Gambar 30. Tabel 15. Nilai komponen utama hasil analisis karakter morfologi. PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 Eigenvalueakar ciri 6.197 4.487 4.10 3.389 2.295 Proportion 0.215 0.155 0.142 0.117 0.080 Cumulative 0.215 0.370 0.512 0.630 0.709 Jumlah sub karakter 6 5 4 3 2 Keterangan : PC = principal component komponen utama. Jumlah karakter terpilih sebagai penentu utama perbedaan karakter morfologi yang mempengaruhi pembentukan pengelompokan berdasarkan nilai akar ciri ada sejumlah 20 sub karakter morfologi. Sub karakter morfologi yang terpilih pada komponen utama ke-1 PC1 sebanyak 6 sub karakter, komponen utama ke-2 PC2 sebanyak 5 sub karakter, komponen utama ke-3 PC3 sebanyak 4 sub karakter, komponen utama ke-4 PC4 sebanyak 3 sub karakter dan komponen utama ke-5 PC5 sebanyak 2 sub karakter. Sub karakter yang terpilih pada masing-masing komponen utama PC1- PC5 disajikan pada Tabel 16. Nilai akar ciri komponen yang tinggi 0.2 terdapat pada sub karakter ukuran bunga besar ø 4 cm yang terdapat pada tanaman mutan 1, mutan 2, mutan 3, mutan 7, mutan 8 dan warna tangkai bunga hijau kekuningan yang terdapat pada tanaman mutan 2, mutan 3 dan S04. Berdasarkan penampilan fenotipe tanaman di lapang terlihat semua mutan yang memiliki akar ciri yang tinggi berpenampilan menarik dan sudah terjadi perubahan secara morfologi dibandingkan dengan tanaman tipe liarnya. Penampilan sub karakter morfologi tersebut tetap stabil sampai pada anakan keenam M1V6 untuk tanaman mutan 1, mutan 2 dan mutan 4. Stabil sampai anakan keempat M1V4 pada mutan 3, serta tetap stabil sampai anakan ketiga M1V3 pada tanaman mutan 7, mutan 8 dan mutan 9. Pengelompokan biplot dua dimensi berdasarkan analisis komponen utama menjadi 5 kelompok besar disajikan pada Gambar 30. Gambar 30. Biplot dua dimensi hasil analisis komponen utama berdasarkan karakter morfologi tanaman mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya. I V IV III II Tabel 16. Sub Karakter morfologi terpilih sebagai pembentuk komponen utama berdasarkan analisis komponen utama. Komponen Utama Jumlah Karak ter Jenis Karak ter Nilai Akar ciri Sub Karakter morfologi penciri utama Terdapat pada Tanaman PC1 6 MF29 -0.144 Irisan melintang akar berwarna kuning Mutan 2, Mutan 4. Mutan 5, Mutan 6 MF47 0.180 Daun menjuntai SpBA, Mutan 3 Mutan 8, Mutan 9, S04, SpBH MF48 -0.180 Daun berdiri tegak Mutan 1, Mutan 2, Mutan 4, Mutan 5, Mutan 6, Mutan 7 MF75 0.157 Penampang melintang sepal dan petal convex recunving cekung SpBA, Mutan 2, Mutan 3, Mutan 7, Mutan 9, S04, SpBH MF76 0.147 Bentu kelopak tangkai bunga hati SpBA, Mutan 2, Mutan 7, Mutan 8, Mutan 9, S04, SpBH MF90 -0.154 Warna mahkota bunga ungu cerah SpBA, Mutan 7, Mutan 8, Mutan 9, SpBH PC2 5 MF09 0.179 Ukuran kormus sedang Mutan 1, Mutan 2, Mutan 3, Mutan 5, Mutan 6, Mutan 7, Mutan 8, Mutan 9 MF19 0.168 Warna kormus hijau keunguan SpBA, Mutan 3, Mutan 7, Mutan 8, Mutan 9 MF38 0.164 Warna batang semu tangkai daun ungu SpBA, Mutan 3, Mutan 5, Mutan 7, Mutan 8, Mutan 9 MF39 -0.164 Warna batang semu tangkai daun hijau Mutan 1, Mutan 2, Mutan 4, Mutan 6, S04, SpBH MF53 -0.161 Warna tunas hijau Mutan 2, Mutan 4, Mutan 6, Mutan 8, S04, SpBH PC3 4 MF71 0.175 Bentuk petal elliptic datar SpBA, Mutan 1, Mutan 2, Mutan 3, Mutan 4, Mutan 6, Mutan 7, S04, SpBH MF117 0.171 Warna side lobe 2 warna Mutan 1, Mutan 2, Mutan 3, Mutan 4 MF168 0.176 Ukuran apical lobe medium Mutan 1, Mutan 2, Mutan 3, Mutan 4, Mutan 8, MF160 0.164 Bentuk petal cekung rata SpBA, Mutan 1, Mutan 2, Mutan 4, Mutan 7, S04, SpBH PC4 3 MF174 -0.210 Ukuran bunga besar diameter 4 cm Mutan 1, Mutan 2, Mutan 3, Mutan7, Mutan 8 MF111 0.191 Warna keping sisi side lobe lateral lobe merah SpBA, Mutan 1, Mutan 3, Mutan 4 MF93 -0.188 Warna mahkota bunga pink sangat muda medekat putih Mutan 2, Mutan 3 PC5 2 MF153 -0.209 Warna tangkai bunga buah hijau kekuningan Mutan 2, Mutan 3 , S04 MF100 -0.180 Warna sepal dorsal dan lateral pink sangat muda mendekati putih Mutan 2, Mutan 3 Pengelompokan berdasarkan akar ciri komponen utama dapat dikelompokkan menjadi 5 kelompok hasil analisis komponen utama yaitu PC1, PC2, PC3, PC4 dan PC5. Kelompok 1 terdiri atas anggrek spesies yaitu SpBA, SO4 dan SpBH. Kelompok 2 terdiri atas tanaman mutan 3, mutan 7, mutan 8, mutan 9. Kelompok 3 terdiri atas mutan 1 dan mutan 2. Kelompok 4 terdiri atas mutan 4. Kelompok 5 terdiri atas mutan 5 dan mutan 6 yang belum mampu menghasilkan bunga sampai dengan 28 bulan setelah diradiasi sinar gamma. Hasil analisis berdasarkan marka morfologi telah mampu mengelompokkan 9 mutan anggrek S. plicata dan 3 pembandingnya menjadi 5 kelompok utama, namun terdapat perbedaan anggota kelompok 2, kelompok 3 dan kelompok 4, sementara kelompok 1 dan 5 memiliki anggota kelompok yang sama dari hasil analisis klustering menggunakan metode UPGMA dan analisis komponen utama yang ditampilkan dalam bentuk plot dua dimensi. Berdasarkan analisis klustering UPGMA menghasilkan kelompok 2 terdiri atas mutan 7, mutan 8 dan mutan 9, kelompok 3 terdiri atas mutan 3 dan kelompok 4 terdiri atas mutan 1 mutan 4 dan mutan 2. Berdasarkan analisis komponen utama dari plot dua dimensi menghasilkan kelompok 2 yang terdiri atas mutan 3, mutan 7, mutan 8 dan mutan 9, kelompok 3 terdiri atas mutan 4 dan kelompok 4 terdiri atas mutan 1 dan mutan 2 Hasil penelitian ini membuktikan bahwa penggunaan data fenotifik dalam bentuk data kualitatif biner dapat memberikan gambaran kekerabatan antara tanaman anggrek S. plicata dengan mutannya. Penggunaan data dalam bentuk biner mempunyai kisaran jarak antara 0 sampai 1, sehingga penentuan kisaran jauh dekatnya kekerabatan dapat ditentukan. Tingkat kepercayaan percobaan ini termasuk kedalam kriteria tinggi 88.76. Menurut Lu 2011 dan Yam 1994, semakin dekat koefisien kemiripan antara satu jenis anggrek akan semakin besar kemiripan dan jarak genetiknya, sehingga kemungkinan untuk dilakukan persilangan akan semakin besar dan tingkat keberhasilannya semakin tinggi. Hubungan kekerabatan atau jarak genetik membawa implikasi di bidang pemuliaan. Semakin tinggi nilai koefisien kemiripan maka kemiripan penampilan tanaman akan semakin tinggi. Hasil penelitian ini memberikan implikasi terhadap pemilihan kombinasi tetua untuk persilangan. Hasil persilangan yang beragam dapat disarankan menggunakan tanaman-tanaman yang memiliki koefisien kemiripan yang rendah Hartatik 2000. Namun tingkat keberhasilan persilangan akan semakin rendah, karena kesesuainnya semakin rendah, bila berhasil maka kemungkinan mendapatkan kombinasi baru yang sangat berbeda, keragamannya tinggi dalam jumlah yang besar menjadi sangat memungkinkan. Analisis Penanda Molekuler ISSR Primer yang mampu menunjukkan kedekatan hubungan antara mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya ditunjukkan dengan munculnya pola pita yang polimorfik pada jarak yang sama menggunakan 10 primer ISSR PKBT 2, PKBT 3, PKBT 4, PKBT 6, PKBT 7, PKBT 8, PKBT 9, ISSRED 12, ISSRED 14 dan ISSRED 20. Amplifikasi primer ISSR terhadap 12 genotipe tanaman mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya 3 kultivar anggrek S. plicata dan 9 mutan hasil iradiasi sinar gamma, telah mampu menghasilkan pola pita polimorfik yang secara rinci ditampilkan pada Tabel 17. Tabel 17. Rincian lokus yang teramplifikasi menggunakan 10 primer ISSR pada 12 genotipe mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya . Lokus ISSR Kriteria Terdapat pada tanaman PKBT2a 2000 bp polimorfik M3 PKBT2b 1300 bp polimorfik M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, S04 PKBT2c 1200 bp polimorfik M3, M4, S04 PKBT2d 1000 bp polimorfik M4 PKBT2e 650 bp polimorfik M3 PKBT2f 400 bp monomorfik Semua PKBT2g 250 bp polimorfik SPBA, M2, M5, M7, M8 PKBT3a 2000 bp polimorfik M1, M2, M7, M8 PKBT3b 1100 bp polimorfik SpBA, M1, M2, M3, M5, M6, M7, M8, S04, SpBH PKBT3c 900 bp polimorfik M2, M7, M8 PKBT3d 800 bp polimorfik M3 PKBT3e 500 bp polimorfik M2,M6,M7,M8,M10 PKBT3f 400 bp polimorfik M3 PKBT3g 250 bp monomorfik Semua PKBT4a 1200 bp polimorfik M4 PKBT4b 1000 bp polimorfik SPBA, M1, M6, S04, SpBH Lokus ISSR Kriteria Terdapat pada tanaman PKBT4c 750 bp polimorfik M4, M6 PKBT4d 600 bp polimorfik M4,M6,M7 PKBT4e 500 bp polimorfik SpBA, M3, M6, SPBH, S04 PKBT4f 250 bp polimorfik SpBA,M1,M2,M3,M5,M6,M7,M8, M9,SpBH, S04 PKBT6a 2000 bp polimorfik M1,M6,M7,M9 PKBT6b 1500 bp polimorfik M4,M10 PKBT6c 1000 bp polimorfik SpBA,M3,M8,SpBH PKBT6d 950 bp polimorfik SpBA, M1,M2,,M7,M9,SpBH, S04 PKBT6e 750 bp polimorfik SpBA,M1,M2,M3,M5,M6,M7,M8,SpBH, S04 PKBT6f 650 bp polimorfik M3,M4 PKBT6g 450 bp polimorfik SpBA,M1,M2,M3,M5,M6,M7,M8,SpBH PKBT6h 350 bp polimorfik SpBA,M1,M2,M3,M4,M6,M7,M8 PKBT6i 250 bp monomorfik Semua PKBT7a 1600 bp polimorfik M3,M4,SpBH,S04 PKBT7b 1100 bp polimorfik M3 PKBT7c 1000 bp polimorfik SpBA,M1,M3, M6,M9,SpBH, S04 PKBT7d 600 bp polimorfik M1,M2,M3,M5,M6,M7 PKBT7e 500 bp polimorfik SpBA,M6,M9 PKBT7f 250 bp monomorfik Semua PKBT8a 750 bp polimorfik M1,M2,M6,M9 PKBT8b 700 bp polimorfik M3,SpBH PKBT8d 500 bp polimorfik M3,M4 PKBT8e 400 bp polimorfik M1,M2,M4,M5,M6,M7,M8,M9,SpBH PKBT8f 350 bp polimorfik M3, S04 PKBT8g 250 bp polimorfik M4 PKBT9a 1000 bp polimorfik SpBA PKBT9b 800 bp monomorfik Semua PKBT9c 750 bp polimorfik SpBA,M1,M3,M5,M6,M7,M9,SpBH, S04 PKBT9d 450 bp polimorfik SpBA,M1,M2,M4,M5,M7,M9, S04 PKBT9e 300 bp polimorfik SpBA,M1,M2,M4,M5,M7,M9, S05 PKBT9f 250 bp polimorfik SpBA,M1,M2,M3,M6,M7,M8 ISSRED 12a 1500 bp polimorfik M3,M4,M6,M7,M8,M9 ISSRED 12b 1200 bp polimorfik SpBH,M6,M7,M8,M9 ISSRED 12c 900 bp polimorfik M5 ISSRED 12d 700 bp polimorfik SpBA,M3,M5 ISSRED 12e 600 bp polimorfik M1,M2,M4,M6,M7,M8,M9,SpBH,S04 ISSRED 12f 500 bp polimorfik SpBA,M4,M5,M7M8,M9 ISSRED14a 1600 bp polimorfik SpBA,M3,SpBH,S04 ISSRED14b 1400 bp polimorfik SpBA ISSRED14c 1000 bp polimorfik SpBA,SpBH Lokus ISSR Kriteria Terdapat pada tanaman ISSRED14d 700 bp monomorfik Semua ISSRED14e 600 bp polimorfik M4,M5,SPBH,S04 ISSRED14f 500 bp polimorfik M3,M4,M6,M7 ISSRED14g 400 bp polimorfik M3,M4,M8,M9,M10,SpBH ISSRED14h 300 bp polimorfik SpBA,M1,M6,M7,M8,M9,SpBH ISSRED14i 250 bp polimorfik SpBH ISSRED20a 2000 bp polimorfik M4 ISSRED20b 1500 bp polimorfik SpBA,M1,M2,M3,M5,M6,M7,M8,M9, SpBH, S04 ISSRED20c 1200 bp polimorfik M4 ISSRED20d 1000 bp polimorfik M4 ISSRED20e 850 bp monomorfik Semua ISSRED20f 750 bp polimorfik M9 ISSRED20g 650 polimorfik SpBA,M2,M3,M4,M6,M7SpBH ISSRED20h 400 polimorfik M6 ISSRED20i 250 polimorfik M1,M5,M7,M8 Keterangan : M1-M9 = mutan 1-mutan 9, SpBA = anggrek S.plicata tipe liar bunga ungu, batang hijau, SpBH = anggrek S.plicata bunga ungu batang hijau, S04 = anggrek S.plicata cv. Alba bunga putih batang hijau. Polimorfisme pola pita yang dihasilkan dari 10 primer ISSR menunjukkan keberagaman yang sangat tinggi hingga mencapai 90.14. Pola pita monomorfik hanya 9.86 yang dihasilkan dari primer PKBT2f ukuran 400 bp, primer PKBT3g ukuran 250 bp, primer PKBT6i ukuran 250 bp, primer PKBT7f ukuran 250 bp, primer PKBT9b ukuran 800 bp, primer ISSRED14d ukuran 700 bp dan primer ISSRED20e ukuran 850 bp. Jumlah lokus yang mampu dihasilkan dengan menggunakan 10 primer ISSR berkisar antara 6-9 lokus per primer. Total hasil amplifikasi mampu menampilkan 71 lokus, yang terdiri atas 64 lokus 90.14 yang tersusun dari pola pita polimormik dan 7 lokus 9.86 tersusun dari pola pita monomorfik Tabel 18, 19. Jumlah lokus yang teramplifikasi tidak berkaitan langsung dengan jumlah pita yang muncul pada gel agarose masing-masing tanaman anggrek S. plicata yang dianalisis menggunakan primer ISSR yang berbeda. Jumlah lokus yang dihasilkan bisa saja sedikit sementara jumlah pita yang muncul cukup banyak, demikian pula sebaliknya, jumlah lokus yang teramplifikasi banyak sedangkan jumlah pita yang dihasilkan masing-masing sampel DNA sedikit, tapi muncul jarak migrasi fragmen DNA yang berbeda. Tabel 18. Rekapitulasi jumlah pita DNA hasil amplifikasi menggunakan 10 primer ISSR anggrek S. plicata dan mutannya. No Primer Jumlah pita Jumlah lokus Jumlah lokus polimorfik Jumlah lokus monomorfik 1 PKBT2 33 7 6 1 2 PKBT3 35 7 6 1 3 PKBT4 28 6 6 4 PKBT6 61 9 8 1 5 PKBT7 33 6 5 1 6 PKBT8 19 6 6 7 PKBT9 45 6 5 1 8 ISSRED12 27 6 6 9 ISSRED14 40 9 8 1 10 ISSRED20 39 9 8 1 Total 360 71 64 90.14 7 9.86 Jumlah lokus dihitung berdasarkan jumlah pita yang muncul pada jarak migrasi fragmen DNA tertentu, sesuai dengan besar atau kecilnya fragmen DNA. Fragmen DNA yang besar akan bergerak lebih lambat, sementara fragmen DNA yang kecil akan bergerak lebih cepat. Pita-pita DNA yang muncul pada sampel DNA yang dianalisis sangat erat hubungannya dengan cocok atau tidaknya primer ISSR yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA genom mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya. Pita hanya akan muncul bila urutan sequent primer cocok dengan urutan basa mikrosatelit yang terdapat tanaman sampel, apabila motif primer yang digunakan tidak cocok dengan motif urutan basa DNA yang terdapat DNA genom maka pita tidak akan muncul gel agarose. Pengelompokan Mutan Anggrek S. plicata dan pembandingnya berdasarkan Profil ISSR Analisis penanda molekuler DNA diperlukan untuk mengevaluasi menganalisis keragaman genetik dan hubungan kekerabatan diantara tanaman mutan, tanaman mutan dengan tipe liarnya dan diantara kultivar anggrek S. plicata yang digunakan sebagai pembanding. Marka molekuler mampu menunjukkan pola perubahan sampai pada level genetik DNA jika dibandingkan dengan karakter morfologi yang dipengaruhi oleh faktor genetik dan lingkungan. Berdasarkan hasil analisis data biner skor pita DNA menggunakan program NTSYS, diperoleh 5 kelompok tanaman pada koefisien kemiripan 0.68 yaitu kelompok 1, merupakan kelompok tanaman anggrek spesies yang digunakan sebagai sumber bahan iradiasi sinar gamma yaitu anggrek S. plicata batang ungu berbunga ungu cerah SpBA, anggrek S. plicata yang digunakan sebagai pembanding yaitu S. plicata batang hijau berbunga ungu SpBH dan S. plicata cv. Alba batang hijau berbunga putih S04 dengan koefisien kemiripan berkisar antara 0.69 –1.00. Kelompok 2 terdiri atas mutan 3 dengan koefisien kemiripan 0.95. Kelompok 3, merupakan kelompok tanaman mutan hasil iradiasi berbagai dosis iradiasi sinar gamma yang meliputi mutan1, mutan 2, mutan 5, mutan 6, mutan 7 dan mutan 8 dengan koefisien kemiripan sebesar 0.61. Kelompok 4 terdiri atas mutan 9 dengan koefisien kemiripannya sebesar 0.61. Kelompok 5 terdiri atas mutan 4 dengan koefisien kemiripannya hanya 0.48 Gambar 31. Gambar 31. Dendrogram analisis kluster berdasarkan karakter molekuler ISSR 9 mutan anggrek S. plicata dan 3 pembandingnya. Berdasarkan dendrogram analisis karakter molekuler menggunakan 10 primer ISSR didapatkan koefisien kemiripan antara kelompok 1 dan kelompok 2 sebesar 0.64. Koefisien kemiripan antara kelompok 3 dengan kelompok 4 sebesar 0.65. Koefisien kemiripan antara kelompok 1, 2 dengan kelompok 3,4 sebesar 0.60. Koefisien kemiripan kelompok 1, 2, 3, 4 dengan kelompok 5 sebesar 0.48 Gambar 31. Pengelompokan tersebut sangat sesuai menggambarkan kedekatan hubungan diantara kultivar tanaman anggrek S. plicata, antara tanaman tipe liar anggrek S. plicata dengan tanaman mutan hasil berbagai dosis iradiasi sinar gamma dan diantara tanaman mutan anggrek S. plicata hasil iradiasi sinar gamma. Nilai goodness of fit matrik korelasi r penanda molekuler mencapai 0.91 dengan kriteria sangat sesuai. Hasil percobaan ini sejalan dengan hasil penelitian Wang et al. 2009, yang menyatakan bahwa tingkat keselarasan pengelompokan ditentukan oleh nilai goodness of fit yaitu kesesuaian antara nilai koefisien kemiripan SM dengan kriteria sangat sesuai r 0.9, sesuai 0.8 r 0.9, tidak sesuai 0.7 r 0.8 dan sangat tidak sesuai r 0.7. Pengelompokan Mutan Anggrek S. plicata dan pembandingnya Berdasarkan Nilai Analisis Komponen Utama Marka Molekuler ISSR Karakter yang menentukan terbentuknya pengelompokan dapat dianalisis menggunakan nilai Analisis Komponen Utama AKUPCA. Tabel 19. Hasil analisis nilai komponen utama berdasarkan nilai akar ciri karakter molekuler mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya. Uraian PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 Eigenvalueakar ciri 2.51 2.08 1.34 1.22 0.95 Proportion 0.23 0.19 0.12 0.11 0.01 Cumulative 0.23 0.41 0.53 0.64 0.73 Jumlah karakter 3 2 1 1 1 Keterangan : PC = principal component komponen utama Pengelompokan aksesi yang memiliki kemiripan berdasarkan karakter molekuler disajikan menggunakan gambar dua dimensi biplot melalui pengukuran analisis komponen utama. Data karakter yang dapat digambarkan melalui hasil analisis komponen utama menggunakan 10 primer ISSR hanya sebesar 70 dari keseluruhan data Tabel 19. Karakter-karakter yang mempengaruhi pembentukan pengelompokan berdasarkan nilai akar ciri Eigenvalue komponen utama ada sejumlah 8 karakter, terdiri dari 3 karakter komponen utama ke-1 PC1, 2 karakter komponen utama ke-2 PC2, 1 karakter komponen utama ke-3 PC3, 1 karakter komponen utama ke-4 PC4 dan 1 karakter komponen utama ke-5 PC5 Tabel 19, 20. Tabel 20. Karakter pita DNA pembentuk komponen utama berdasarkan marka ISSR. Komponen Utama Jumlah Karakter Jenis Karakter Nilai Terdapat pada Tanaman PC1 3 ISSRED14a 1600 bp 0.244 SpBA, Mutan 3, S04, SpBH PKBT7a 1600 bp 0.271 Mutan 3, Mutan 4, S04, SpBH PKBT4e 500 bp 0.234 SpBA, Mutan 3, Mutan 6, S04, SpBH PC2 2 PKBT4b 1.000 bp -0.225 SpBA, Mutan1, Mutan 3, Mutan 6,S04, SpBH PKBT7c 1.000 bp -0.211 SpBA, Mutan 1, Mutan 3, Mutan 6, Mutan 9, S04, SpBA PC3 1 ISSRED14f 500 bp 0.312 Mutan 3, Mutan 4, Mutan 6, Mutan 7 PC4 1 PKBT6h 350 bp 0.340 SpBA, Mutan 1, Mutan 2, Mutan 3, Mutan 4, Mutan 6, Mutan 7, Mutan 8 PC5 1 ISSERD12b 1 200 bp 0,280 SpBA, Mutan 6, Mutan 7, Mutan 8, Mutan 9 Berdasarkan analisis komponen utama Tabel 20 penanda molekuler anggrek S. plicata dan mutannya ternyata membentuk pengelompokan yang sama dengan hasil pengelompokan menggunakan program analisis pengelompokan clustering data dengan SAHN Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested-UPGMA Unweighted pair-group method arithmatic average Soltis et al. 1998. Primer ISSR PKBT6h dengan posisi pita 350 bp, memiliki nilai komponen utama yang tertinggi 0.340. Tanaman yang memiliki pita primer PKBT6h pada posisi 350 bp adalah SpBA, mutan 1, mutan 2, mutan 3, mutan 4, mutan 6, mutan 7 dan mutan 8. Primer ISSR yang mampu menyusun nilai komponen utama terbanyak adalah Primer ISSR PKBT 4 dengan posisi pita 500 bp terdapat pada tanaman SpBA, mutan 3, mutan 6, S04 dan SpBH dan posisi pita 1000 bp yang terdapat pada tanaman SpBA, mutan 1, mutan 3, mutan 6, S04 dan SpBH, seperti yang disajikan Gambar 32. Gambar 32. Karakter pola pita DNA hasil amplifikasi menggunakan primer ISSR PKBT 6 atas dan PKBT 4 bawah pada mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya. Hasil analisis komponen utama yang dapat digambarkan ke dalam gambar dua dimensi biplot, menggunakan penanda molekuler anggrek S. plicata beserta mutannya membentuk 5 kelompok yaitu kelompok 1 terdiri atas SpBA, S04, SpBH. Kelompok 2 teridri atas mutan 3. Kelompok 3 terdiri atas mutan 1, mutan 2, mutan 5, mutan 6, mutan 7 dan mutan 8. Kelompok 4 terdiri atas mutan 9. Kelompok 5 terdiri atas mutan 4. Pengelompokan berdasarkan komponen utama hanya mampu mencerminkan 70 dari keseluruhan data. Gambar 33. Gambar 33. Hasil analisis komponen utama yang digambarkan ke dalam gambar dua dimensi, menggunakan penanda molekuler ISSR mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya. Penggunaan marka molekuler ISSR sangat efektif digunakan untuk menentukan kekerabatan berdasarkan koefisien kemiripan dan analisis komponen utama diantara tanaman mutan hasil iradiasi sinar gamma, diantara anggrek S. plicata yang digunakan sebagai pembanding dan antara mutan dengan tipe liarnya. Koefisien kemiripan ≥ 0.68 antara tanaman anggrek spesies dengan mutannya menandakan bahwa terjadi perubahan atau perbedaan sebesar 40, sehingga secara morfologi dapat dibedakan dengan jelas perbedaan antara mutan dengan tipe liarnya. Perbedaan utama yang terjadi pada tanaman mutannya adalah perubahan warna bunga, yang dihasilkan pada mutan 1, mutan 2, mutan 3, mutan 7 dan mutan 9. Warna bunga yang didapatkan pada mutan-mutan anggrek S. plicata berkisar mulai dari warna pink sangat muda mutan 2, gradasi warna pink cerah dengan kuning mutan 1, warna bunga pink muda dengan bintik-bintik pink tua mutan 3, pink muda mutan 9, serta warna sepal pink muda yang dikombinasikan dengan warna ungu cerah pada petalnya mutan 7. Perubahan bentuk petal bunga dari petal yang berbentuk rata menjadi bergelombang mutan 8, serta terjadi penyatuan sepal lateral mutan 9. Perubahan yang sangat besar terjadi pada mutan 4 dengan koefisien kemiripan hanya 0.48 karena terjadi perubahan warna bunga petal dan sepalnya menjadi kuning cerah, tinggi tanaman berkurang sampai 60, dan ukuran daun berkurang sampai 74.6, sehingga dalam analisis clustering dengan SAHN-UPGMA maupun analisis komponen utama terlihat terjadi pemisahan dengan kelompok mutan lainnya. Pengelompokan berdasarkan marka molekuler ISSR ternyata sangat sensitif dan dapat digunakan untuk tanaman-tanaman dengan level variasi genetik yang rendah, dan sangat berguna sebagai alat pendeteksi keragaman genetik suatu spesies tanaman yang mempunyai variasi genetik yang sangat luas. Teknik ISSR juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies, kultivar ataupun populasi suatu spesies yang mirip Wang et al. 2009. Identifikasi secara molekuler menggunakan marka ISSR sudah berhasil dan sangat efektif digunakan pada berbagai jenis tanama, diantaranya sudah dilakukan untuk mendeteksi keragaman genetik 31 spesies anggrek Dendrobium Wang et al. 2009. Identifikasi keragaman genetik 10 aksesi landraces Vigna umbellata Muthusamy 2008. Identifikasi Keragaman genetik Scutellaria baicalensis Guo et al . 2009. Analisis genetik tanaman casuarinas Yasodha et al. 2004. Penaksiran variasi genetik diantara populasi Rynchostylis retusa anggrek efifit dari Goa Parab dan Khrisnan 2008. Identifikasi senescent daun bendera di bawah kondisi stres air gandum Triticum aestivum L. Milad et al. 2011. Penaksiran keragaman genetik 14 kultivar tanaman obat penting Catharanthus roseus Shaw et al. 2009. Hubungan cladistic diantara genus-genus Cinnamomum Lauraceae berdasarkan morfologi daunnya Ho dan Hung 2011. Penaksiran Keragaman Genetik enam kultivar Catharanthus roseus dari Gujarat Tengah India Sanjay et at. 2011. Sidik jari molekuler penanda populasi anggrek Dendrobium officinale KIMURA et MIGO Shen et al. 2006. Penaksiran keragaman genetik 151 kultivar anggrek Cymbidium sinense Lu et al. 2011. Kesimpulan Hasil analisis keragaman genetik berdasarkan marka morfologi dan marka molekuler menggunakan ISSR terhadap 9 tanaman mutan anggrek S. plicata hasil iradiasi sebelas taraf dosis sinar gamma dan 3 kultivar S. plicata sebagai pembandingnya, dapat ditarik beberapa kesimpulan sebagai berikut : 1. Polimorfisme keragaman morfologi yang berasal dari 70 karakter yang dapat dirinci menjadi 177 sub karakter mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya dikatagorikan tinggi yaitu mencapai 89.27. 2. Hasil analisis klustering karakter morfologi menggunakan metode UPGMA pada koefisien kemiripan 0.68 dan analisis komponen utama telah mampu mengelompokkan 9 mutan anggrek S. plicata dan 3 pembandingnya menjadi 5 kelompok utama, dengan nilai goodness of fit matriks korelasi r sebesar 0.89 sesuai. 3. Total pita yang dihasilkan dari 10 primer ISSR sebanyak 360 pita, yang tersebar ke dalam 71 lokus ISSR. Polimorfisme pola pita DNA yang dihasilkan dari 10 primer ISSR menunjukkan keberagaman yang sangat tinggi hingga mencapai 91.14. 4. Hasil analisis klustering pola pita ISSR menggunakan metode UPGMA pada koefisien kemiripan 0.68 dan analisis komponen utama terhadap 9 mutan anggrek S. plicata dan 3 pembandingnya mampu dibedakan dengan tegas menjadi 5 kelompok utama dengan nilai goodness of fit matrik korelasi r penanda molekuler mencapai 0.91 sangat sesuai. Daftar Pustaka Azrai M. 2005. Pemanfaatan marka molekuler dalam proses seleksi pemuliaan tanaman. Jurnal Agro Biogen 11:26-37. [Balithi]. 2007. Panduan Karakterisasi Tanaman Anggrek, Balithi-Segunung. Cipanas. Guo HB, Huang KY, Zhou TS, Wu QH, Zhang YJ, Liang ZS. 2009. DNA isolation, optimization of ISSR-PCR system and primers screening of Scutellaria baicalensis . Journal of Medicinal Plants Research 311: 898-901. Hartatik. 2000. Studi Genetik Plasma Nutfah Tebu Saccharum spp. Berdasarkan penanda Morfologi, Agronomi dan Isozim. [Tesis] Program Pascasarjana IPB Bogor. 138pp. Ho Y, Hung TY. 2011. Cladistic relationships within the genus Cinnamomum Lauraceae in Taiwan based on analysis of leaf morphology and inter-simple sequence repeat ISSR and internal transcribed spacer ITS molecular markers. African Journal of Biotechnology 1024:4802-4815. Kumar, P. 2009. Potential of molecular markers in plant biotechnology. Review Article. Plant Omics J. 24:141-162. Liu JJ, Ekramoddoullah AKM, Hunt R, Zainal A. 2006. Iditification and characterization of RAPD markers linked to a major gene Cr2 for resistant to Cronartium ribicola Fish. in Pinus monticola D.Don.. Phytopathology 96:395-399. Liu LW, Zhao LP, Gong YQ, Wang MX, Chen LM, Yang JL, Wang Y, Yu FM, Wang LZ. 2008. DNA fingerprinting and genetic diversity analysis of late- bolting radish cultivars with RAPD, ISSR and SRAP markers. Scientia Horticulturae. 1163: 240 –247. Lu J, Hu X, Liu J, Wang H. 2011. Genetic diversity and population structure of 151 Cymbidium sinense cultivars. Journal of Horticulture and Forestry 34: 104-114. Milad SI, Wahba LE, Barakat MN. 2011. Identification of RAPD and ISSR markers associated with flag leaf senescence under water stressed conditions in wheat Triticum aestivum L.. AJCS 53:337-343. Muthusamy S, Kanagarajan S, Ponnusamy S. 2008. Efficiency of RAPD and ISSR markers system in accessing genetic variation of rice bean Vigna umbellata landraces. Electronic Journal of Biotechnology 113:1-10. Parab GV, Khrisnan S. 2008. Assessment of genetic variation among populations Rynchostylis retusa , an epiphitic orchid from Goa, India using ISSR and RAPD markers. Indian Journal of Biotechnology 7:313-319. Rohlf FJ. 1998. NTSYS-PC. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, Version 2.00. Exeter Software, Setauket. New York. Sá OJ, Pereira A, Baptista P. 2011. Optimization of DNA extraction for RAPD and ISSR analysis of Arbutus unedo L. Leaves. Int. J. Mol. Sci. 12: 4156-4164. Sanjay LS, Mistry KN, Shah SD, Thaker R, Vaidya PB. 2011. Genetic diversity assessment in nine cultivars of Catharanthus roseus from Central Gujarat India through RAPD, ISSR and SSR markers. Journal of research in Biology 8: 667-675. Shaw RK, Acharya L, Mukherjee AK. 2009. Assessment of genetic diversity in a highly valuable medicinal plant Catharanthus roseus using molecular markers. Crop Breeding and Applied Biotechnology 9: 52-59. Shen J, Ding X, Liu D, Ding G, He J, Li X, Tang F, Chu B. 2006. Inter-simple sequence repeats ISSR molecular fingerprinting markers for authenticating populations of Dendrobium officinale KIMURA et MIGO. Biol. Pharm. Bull. 293:420-422 . Soltis ED, Soltis SP, Doyle JF. 1998. Contributions of PCR-Based Methods to Plant Systematics and Evolution Biology. Molecular Systematics of Plants II DNA Sequencing. Massachussets. Kluwer Academic Publishers. Trojanowska MR, Bolibok H. 2004. Characteristics and comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants. Cellular and Mol. Biol. Letters 9 : 221-238. Wang HZ, Feng SG, Lu JJ, Shi NN, Liu JJ. 2009. Phylogenetic studi and molecular identification of 31 Dendrobium species using inter-simpel sequent repeat ISSR markers. Scientia Horticultura 122:440-447. Yam TW. 1994. Breeding with Paraphlaenopsis. American Orchid Society Bulletin. 6312:1359-1365. Yasodha R, Kathirvel M, Sumathi R, Gurumurthi K, Archak S, Nagaraju J. 2004. Genetic analyses of Casuarinas using ISSR and FISSR markers. Genetica 122: 161 –172. Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat SSR anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183. BAB. VIII. PEMBAHASAN UMUM Panduan perbanyakan anggrek tanah termasuk anggrek S. plicata yang standar sampai saat ini belum tersedia, sehingga sangat penting untuk dilakukan penelitian secara menyeluruh mulai dari teknik perbanyakan secara in vitro untuk penyediaan benih berkualitas maupun teknik budidaya tanaman di lapang untuk mendapatkan pertumbuhan terbaik. Tersedianya teknik perbanyakan massal secara in vitro untuk perbanyakan klonal anggrek S. plicata dan teknik budidayanya sangat penting dan merupakan syarat mutlak untuk tujuan komersialisasi. Anggrek S. plicata saat ini sudah mulai diminati pasar untuk keperluan ornamen taman di perkantoran, rumah sakit dan perumahan yang berwawasan lingkungan di daerah perkotaan. Penggunaan anggrek sebagai ornamen taman akan menambah eksotisme taman-taman tersebut. Seiiring dengan permintaan pasar yang semakin meningkat terhadap produk anggrek, maka ketersediaan bahan tanam dalam jumlah yang cukup, mudah didapat dengan harga yang terjangkau menjadi persyaratan utama. Selain itu tersedianya varian anggrek S. plicata yang beragam bentuk dan warna bunganya sangat penting, supaya konsumen mempunyai banyak pilihan sesuai dengan kebutuhan dan peruntukan yang berbeda beda. Penelitian ini telah dapat memecahkan beberapa masalah penting anggrek S. plicata , terutama dalam penyediaan protokol perbanyakan klonal secara in vitro untuk mendapatkan pertumbuhan dan multiplikasi plb dan planlet terbaik. Hasil penelitian ini telah mampu pula mendapatkan teknik perbanyakan klonal dalam penyediaan benih massal secara in vitro. Anggrek S. plicata termasuk tanaman yang berbiak vegetatif fakultatif yang umumnya diperbanyak secara vegetatif melalui pemisahan anakan, selain itu dapat pula diperbanyak menggunakan biji. Di alam, biji dihasilkan dari penyerbukan dengan bantuan serangga. Biji anggrek tidak mempunyai endosperm. Biji dapat tumbuh pada permukaan akar yang melekat pada permukaan medium tumbuh, namun persentase perkecambahan biji sangat rendah yaitu sekitar 2 saja dari total biji yang dihasilkan dari setiap buah. Pertumbuhan optimum biji anggrek yang tidak mempunyai endosperma dapat ditabur pada medium in vitro. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa perkecambahan biji membentuk plb mencapai 90 pada medium Vacint dan Went VW maupun medium Murashige dan Skoog MS yang telah dilakukan modifikasi dengan penambahan bahan organik kompleks, formulasi vitamin dan gula serta penambahan beberapa jenis dan konsentrasi sitokinin. Hasil optimasi medium kultur menggunakan berbagai jenis dan konsentrasi bahan organik kompleks untuk pertumbuhan dan perkembangan biji membentuk plb, selanjutnya perkembangan plb membentuk planlet, telah didapat medium terbaik. Penambahan air kelapa dengan konsentrasi 50-100 ml L -1 baik kedalam medium MS maupun medium VW sangat baik untuk menabur biji anggrek S. plicata . Biji anggrek berkembang menjadi plb setelah 6 minggu. Pertumbuhan plb sekaligus multiplikasi plb yang tinggi dapat dipertahankan dengan menggunakan medium MS + 50 - 100 ml L -1 air kelapa selama 6 minggu, selanjutnya dilakukan sub kultur ke medium MS + 2 arang aktif selama 6 minggu. Pertumbuhan optimum plb dan planlet dapat dilakukan dengan cara melakukan sub kultur berulang ke medium dengan penambahan arang aktif bersalang seling dengan medium tanpa arang aktif setiap enam minggu. Penambahan bubur pisang ambon sebanyak 50 - 100 g L -1 ke dalam medium MS atau VW juga baik untuk multiplikasi dan pembesaran plb menjadi planlet, namun penggunaan medium pisang ambon mudah terkontaminasi terutama oleh jamur. Multiplikasi plb dan planlet serta perkembangan plb menjadi planlet anggrek S. plicata yang terbaik dapat menggunakan medium MS yang dimodifikasi vitaminnya menggunakan vitamin B5 + 75 ml L -1 air kelapa atau menggunakan medium MS dengan vitamin + BA 20 μM + 2 arang aktif dengan penambahan gula sebanyak 30 g L -1 . Medium yang dapat digunakan untuk penguatan planlet adalah medium MS atau ½ MS dengan penambahan 2 arang aktif dan peningkatan konsentrasi gula menjadi 40 g L -1 . Medium MS atau ½ MS dengan penambahan arang aktif sangat baik untuk pertumbuhan akar dan untuk menstabilkan pertumbuhan planlet anggrek S. plicata yang di sub kultur terus menerus di dalam medium yang menggunakan zat pengatur tumbuh. Penggunaan zat pengatur tumbuh terus menerus dapat menyebabkan plb dan planlet mengalami stagnasi pertumbuhan akibat terakumulasinya zat pengatur tumbuh dalam konsentrasi tinggi didalam sel Torres 1989. Konsentrasi zat pengatur tumbuh yang melebihi kebutuhan akan menjadi faktor penghambat pertumbuhan itu sendiri, karena zat pengatur tumbuh yang dibutuhkan hanya konsentrasi kecil saja, bila diberikan melebihi kebutuhan dan diberikan secara kontinyu dapat menyebabkan terjadinya toksisitas Moore 1979. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa plb maupun planlet yang ditanam pada medium dengan penambahan sitokinin sintetik secara terus menerus dapat menyebabkan plb dan planlet menjadi browning dan cepat mengalami kematian. Baiknya pertumbuhan dan multiplikasi plb menggunakan air kelapa diduga karena anggrek lebih menyukai sitokinin alami. Komposisi air kelapa lebih kompleks dibandingkan dengan sitokinin sintetik seperti BA dan kinetin. Air kelapa disamping mengandung zeatin, dan dihydrozeatin juga terdapat diphenyl urea, gula dan beberapa senyawa organik lainnya Mederos-Molina 2004. Senyawa organik yang terkandung di dalam air kelapa sangat dibutuhkan dan sangat sesuai dengan kebutuhan plb dan planlet untuk mendukung pertumbuhan terbaik. Kriteria planlet yang sudah dapat diaklimatisasi antara lain sudah memiliki daun minimum 4 lembar dan sudah terbentuk akar, sebaiknya akar jangan terlalu panjang karena akan rusak pada saat dikeluarkan dari botol kultur. Medium aklimatisasi terbaik untuk anggrek S. plicata adalah menggunakan moss pada bagian pangkal batang selanjutnya ditanam pada medium campuran tanah : kompos : akar pakis dengan perbandingan 1 : 1 : 1. Pemindahan ke pot satuan sebaik dilakukan setelah umur 2 bsi. Ciri-ciri seedling yang sudah bisa dipindah antara lain sudah terbentuk akar dan daun baru pada medium aklimatisasi. Medium untuk pembesaran tanaman dapat menggunakan campuran tanah : kompos : akar pakis dengan perbandingan 2 : 1 : 1. Pemupukan untuk mengoptimalkan pertumbuhan vegetatif menggunakan pupuk cair dengan komposisi NPK 32-10-15. Setelah tanaman tumbuh baik memiliki daun 4 buah fase remaja selanjutnya dilakukan induksi pembungaan dengan pemberian pupuk daun dengan komposisi NPK 20-20-20. Pemupukan dilakukan setiap dua minggu sekali dengan cara menyiram larutan pupuk merata diatas permukaan medium atau menyemprotkannya ke semua permukaan tanaman. Volume pemupukan adalah 20 mlpot. Pemupukan dilakukan pada pagi atau sore hari. Pengendalian penyakit dilakukan dengan menyemprot tanaman setiap bulan menggunakan Previcur-N dengan konsentrasi 2 ml L -1 . Penyemprotan dilakukan sebulan sekali dengan konsentrasi 2 ml L -1 . Pengendalian gulma dilakukan secara manual dengan mencabut setiap gulma yang tumbuh setiap minggu. Hasil penelitian ini juga telah mampu meningkatkan keragaman bentuk dan warna plb, plantlet, daun, bunga, serta idiotipe anggrek S. plicata, dari yang berwarna standar ungu cerah menjadi lebih beragam bentuk maupun warna bunganya menggunakan teknik iradiasi sinar gamma pada lini klon plb dan planlet . Induksi mutasi menggunakan iradiasi sinar gamma 60 CO pada plb maupun planlet dapat meningkatkan keragaman genetik anggrek S. plicata. Radiosensitivitas plb terhadap dosis iradiasi sinar gamma lebih rendah dibandingkan dengan planlet. Mutan hasil iradiasi plb dihasilkan pada kisaran dosis 30-70 Gy, sementara mutan hasil iradiasi planlet didapatkan pada kisaran dosis 30-100 Gy. Radiosensitivitas plb berdasarkan pengukuran lethal dosis 50 LD 50 untuk persentase jumlah plb hidup adalah 47.71 Gy dan persentase pembentukan plb baru adalah 34.40 Gy. Radiosensitivitas planlet berdasarkan pengukuran LD 50 untuk persentase planlet hidup adalah 50.74 Gy dan LD 50 persentase jumlah anakan baru adalah 33.78 Gy. Radiosensitivitas plb dan planlet sangat penting untuk diketahui dengan tepat dan kapan saatnya menentukan LD 50 supaya dapat dijadikan patokan untuk iradiasi plb dan planlet S. plicata guna mendapatkan mutan terbanyak. Hasil penelitian ini mendapatkan saat terbaik untuk penentuan LD 50 dari plb dan planlet yang diiradiasi dengan dosis 0-100 Gy adalah pada 7 bsi, karena sebelum 7 bsi pengaruh iradiasi belum stabil, karena plb dan planlet anggrek termasuk tanaman yang responnya lambat. Fenomena yang ditunjukkan dari hasil penelitian ini adalah kematian plb dan planlet anggrek S. plicata terjadi secara perlahan sampai dengan 4 bsi. Plb planlet baru stabil pada 5 bsi tidak ada yang mati, namun belum terlihat adanya pertumbuhan baru, diduga saat ini sudah mulai terjadi pemulihan akibat iradiasi dan pada 6 bsi baru terlihat adanya pertumbuhan kembali plb yang ditandai dengan terjadinya plb baru atau berkembang membentuk planlet. Pengamatan pada 7 bsi sudah dapat diidentifikasi plb dan planlet yang berbeda dengan tipe liarnya. Hasil karakterisasi secara in vitro terhadap plb hasil iradiasi pada 7 bsi telah dihasilkan plb yang berbeda yaitu plb ungu, plb kimera dan plb albino. Planlet yang berbeda juga ditemukan dari perkembangan plb mutan antara lain didapatkan planlet variegata ungu-hijau, planlet albino, planlet yang memiliki daun keriting, daun melintir, daun variegata klorofil dan daun albino. Penggunaaan teknik iradiasi sinar gamma pada planlet yang dilakukan karakterisasi dan seleksi di rumah kawat, telah mampu mendapatkan 9 mutan harapan atau sebesar 0.36 dari total planlet yang diradiasi berdasarkan kriteria bentuk dan warna bunganya. Kejadian mutan berdasarkan bentuk dan warna bunga yang telah berhasil didapatkan sangat kecil namun sangat penting dalam sumbangan pengetahuan pemuliaan mutasi, terutama sebagai pembuktian bahwa penggunaan teknik induksi mutasi telah mampu meningkatkan keragaman genetik anggrek S. plicata . Hasil pengamatan karakter bentuk dan warna bunga terhadap anakan yang dihasilkan dari pembiakan vegetatif menunjukkan adanya kestabilan mutan sampai pada generasi ketiga M1V3 untuk mutan 3, mutan 7, mutan 8 dan mutan 9. Mutan stabil sampai generasi keenam M1V6 sudah didapat pada mutan 1, mutan 2 dan mutan 4. Mutan yang berbeda warna bunganya petal dan sepal dibandingkan dengan tipe liarnya adalah mutan 1, mutan 2, mutan 3 dan mutan 4. Perubahan warna bunga akibat iradiasi sinar gamma adalah gradasi warna pink-kuning mutan 1, pink sangat muda muatan 2, kuning muda bintik-bintik pink fanta mutan 3, kuning cerah mutan 4. Perubahan warna sepal menjadi lebih muda mutan 7. Mutan dengan perubahan bentuk bunga dihasilkan pula dalam penelitian ini, yaitu perubahan bentuk petal dari datar menjadi bergelombang mutan 8 serta terjadi penyatuan sepal lateral mutan 9. Diantara 9 mutan potensial yang sudah didapatkan, yang berpotensi untuk dilepas sebagai varietas baru maupun dijadikan tetua persilangan, diantaranya mutan 1, mutan 2, mutan 3 dan mutan 4. Keempat mutan tersebut mempunyai keunggulan bila dibandingkan dengan tipe liarnya, antara lain warna bunganya berbeda dan merupakan varian baru yang lebih indah, lama mekar bunga berkisar antara 5-14 hari, jumlah tangkai bunga lebih banyak dan bunga mekar bersamaan lebih banyak, sehingga sangat potensial untuk dijadikan tanaman hias untuk ornamen taman, karena sangat indah bila ditanam dalam bentuk hamparan atau berkelompok. Khusus untuk mutan 4, merupakan idiotipe baru anggrek S. plicata dengan kriteria tanamannya kecil, mempunyai anakan yang banyak dan rajin berbunga, bunganya berwarna kuning cerah, sehingga sangat potensial dijadikan tanaman pot. Mutan 8 berpotensi untuk dijadikan tetua persilangan, karena mempunyai petal yang bergelombang, untuk menghasilkan varian baru bentuk bunga yang bergelombang. Identifikasi tanaman mutan sangat penting untuk menentukan apakah perbedaan morfologi bentuk dan warna bunga yang dihasilkan melalui induksi mutasi sudah sampai pada level genetik sehingga bisa dikagorikan sebagai tanaman mutan atau hanya fenomena epigenetik yaitu perubahan sesaat yang terjadi akibat perlakuan iradiasi sinar gamma, setelah beberapa saat tanaman akan mampu memulihkan diri dan kembali ke bentuk tipe liarnya. Umumnya fenomena epigenetik akan tetap stabil perubahannya bila diperbanyak secara vegetatif. Penelitian ini telah berhasil mengidentifikasi variasi genetik tanaman mutan anggrek S. plicata akibat iradiasi sinar gamma menggunakan karakter morfologi maupun marka molekuler. Karakterisasi berdasarkan penanda morfologi biasanya dipengaruhi oleh lingkungan makro dan mikro, sementara karakterisasi menggunakan marka molekuler tidak dipengaruhi oleh lingkungan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa penggunaan marka ISSR ternyata lebih akurat menidentifikasi keragaman genetik dibandingkan dengan menggunakan karakter morfologi. Pengamatan morfologi harus dilakukan pada semua bagian tanaman, mulai dari akar, batang, daun, bunga, buah dan biji. Pengamatan anatomi seperti stomata, analisis jaringan akar, batang dan daun sebaiknya juga dilakukan, karena semakin banyak karakter morfologi yang diamati maka hasilnya akan semakin akurat. Pendeteksian keragaman morfologi anggrek S. plicata dan mutannya sudah dapat diamati sebanyak 70 karakter yang setara dengan 71 lokus pada penanda molekuler ISSR. Setiap karakter diperoleh keragaman morfologi sebanyak 177 sub karakter yang setara dengan 360 pita yang muncul pada gel agarose hasil elektroforesis menggunakan marka molekuler ISSR. Kendala utama dalam karakterisasi adalah terdapat 2 tanaman mutan yaitu mutan 5 dan mutan 6 yang belum berbunga, sehingga karaktersasi untuk fase generatif tanaman belum dapat dilakukan. Akibatnya terjadi perbedaan pengelompokan berdasarkan analisis kluster antara marka morfologi dengan marka molekuler menggunakan ISSR karena adanya perbedaan koefisien kemiripan hasil rekapitulasi jarak euclidian seperti yang disajikan pada Tabel 21. Koefisien kemiripan antara mutan dengan pembandingnya dapat dilihat pada Lampiran 1 untuk marka morfologi dan Lampiran 2 untuk marka ISSR. Tabel 21. Rekapitulasi matrik jarak euclidian mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya berdasarkan koefisien kemiripan menggunakan marka morfologi dan marka molekuler ISSR. Perbandingan tanaman Koefisien kemiripan morfologi Koefisien kemiripan molekuler SpBA vs SpBA 1.00 1.00 Mutan 1 vs SpBA 0.49 0.61 Mutan 2 vs SpBA 0.54 0.61 Mutan 3 vs SpBA 0.66 0.65 Mutan 4 vs SpBA 0.52 0.48 Mutan 5 vs SpBA 0.36 0.61 Mutan 6 vs SpBA 0.32 0.61 Mutan 7 vs SpBA 0.64 0.61 Mutan 8 vs SpBA 0.62 0.61 Mutan 9 vs SpBA 0.73 0.61 S04 vs SpBA 0.66 0.70 SpBH vs SpBA 0.83 0.70 Penggunakan marka morfologi terbentuk 5 kelompok, tanaman yang belum berbunga yaitu mutan 5 dan mutan 6 membentuk kelompok sendiri dengan koefisien kemiripan sangat rendah 0.32 – 0.36 dibandingkan dengan tanaman tipe liarnya. Berdasarkan marka ISSR kedua tanaman tersebut masuk ke dalam kelompok tanaman mutan, dengan koefisien kemiripan yang sama dengan kelompok mutan hasil iradiasi lainnya yaitu 0.61 . Marka morfologi mengelompokkan mutan 4 yang memiliki bunga kuning cerah dengan mutan 1 dan mutan 2 menjadi satu kelompok dengan koefisien kemiripan antara 0.48-0.54. Menggunakan marka ISSR mutan 4 mengelompok sendiri berbeda dengan kelompok tanaman mutan lainnya dan kelompok tanaman anggrek S. plicata spesies dengan koefisien kemiripan hanya 0.48. Keunggulan lainnya menggunakan marka molekuler adalah jumlah sampel. Sampel tanaman yang digunakan untuk marka morfologi adalah semua organ tanaman akar, batangkormus, daun, bunga, buah dan biji, semua fase pertumbuhan tanaman dan biasanya hanya dapat diamati karakter kualitatifnya saja. Penggunaan marka ISSR untuk mengidentifikasi keragaman genetik cukup menggunakan 0.3 gram sampel daun muda sudah dapat memberikan gambaran yang akurat dan menyeluruh tentang perbedaan genetik antara tanaman anggrek S plicata dengan mutannya. Jadi dengan menggunakan marka ISSR tidak perlu menunggu sampai tanaman berbunga terlebih dahulu, karena sudah dapat diidentifikasi keragaman genetiknya mulai dari fase planlet di dalam botol kultur. Keuntungan lain menggunakan marka molekuler antara lain sudah dapat melakukan seleksi sedini mungkin, mulai dari fase bibit dalam kultur in vitro dan tidak perlu menunggu sampai tanaman menyelesaikan satu suklus hidup yang lengkap. Hasil analisis menggunakan marka ISSR mutan 1, mutan 2, mutan 3, mutan 5, mutan 6, mutan 7, mutan 8 dan mutan 9 yang memiliki koefisien kemiripan berkisar antara 0.61- 0.65 diduga mengalami mutasi kecil atau mutasi titik point mutation pada beberapa basa DNA dibandingkan dengan tipe liarnya. Dugaan tersebut diperkuat dengan perubahan morfologi yang terjadi hanya terdapat pada bentuk daun pada 2 mutan mutan 5 dan mutan 6 , perubahan warna bunga pada 5 mutan mutan 1, mutan 2, mutan 3, mutan 4 dan mutan 7 dan terjadi perubahan bentuk bunga pada 2 mutan mutan 8 dan mutan 9, sementara karakter morfologi lainnya tidak mengalami perubahan. Mutasi besar sampai pada level kromosom diduga terjadi pada mutan 4, karena selain terjadi perubahan warna bunga juga terjadi perubahan idiotipe pertumbuhan tanaman. Penurunan tinggi tanaman mencapai 60 sementara pengurangan ukuran daun mencapai 72. Keunggulan penggunaan teknik iradiasi sinar gamma dibandingkan dengan penggunaan teknik hibridisasi melalui persilangan antara lain 1 dapat menciptakan keragaman baru yang sangat berbeda dibandingkan dengan tipe liarnya, 2 dapat digunakan untuk memperbaiki hanya sifat-sifat tertentu yang belum terdapat pada tanaman budidaya yang sudah unggul, 3 seleksi dapat dilakukan untuk berbagai jenis sifat yang diinginkan pada tanaman hasil iradiasi, 4 merupakan cara yang sangat efektif untuk menciptakan keragaman baru terutama untuk tanaman yang berbiak secara vegetatif obligat, 5 bahan iradiasi dapat menggunakan berbagai jenis organ dan berbagai jenis tahapan pertumbuhan tanaman tergantung pada tujuan yang diingin, dan 6 dapat menghasilkan tanaman variegata yang sangat diinginkan untuk menciptakan keragaman baru terutama untuk tanaman hias. Hubungan kekerabatan atau jarak genetik membawa implikasi di bidang pemuliaan. Semakin tinggi nilai koefisien kemiripan maka kemiripan penampilan tanaman akan semakin tinggi. Hasil penelitian ini memberikan implikasi terhadap pemilihan kombinasi tetua untuk persilangan, untuk mendapatkan hasil yang beragam dapat disarankan menggunakan tanaman yang memiliki koefisien kemiripan yang rendah Hartatik 2000. Pengelompokan berdasarkan marka molekuler ISSR ternyata sangat sensitif dan dapat digunakan untuk tanaman-tanaman dengan level variasi genetik yang rendah, dan sangat berguna sebagai alat pendeteksi keragaman genetik suatu spesies tanaman yang mempunyai variasi genetik yang sangat luas. Teknik ISSR juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies, kultivar ataupun populasi suatu spesies yang mirip Wang et al. 2009.

BAB IX. KESIMPULAN UMUM DAN SARAN

Kesimpulan Umum Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan beberapa hal penting sebagai berikut. 1. Perbanyakan massal secara klonal yang standar dan terbaik untuk pertumbuhan dan multiplikasi plb anggrek S. plicata secara in vitro telah berhasil didapatkan. Medium untuk pertumbuhan dan perkembangan biji anggrek danmultiplikasi plb adalah medium MS + 50- 100 ml L -1 air kelapa dan medium VW + 50-100 ml L -1 air kelapa. Perkembangan plb menjadi plantlet dan multiplikasi plantlet anggrek S. plicata yang terbaik dapat menggunakan medium MS vitamin B5 + 75 ml L -1 air kelapa atau menggunakan medium MS + BA 20 μM + 2 arang aktif. 2. Induksi mutasi menggunakan iradiasi sinar gamma pada plb maupun plantlet sudah mampu meningkatkan keragaman genetik anggrek S. plicata. Radiosensitivitas plb terhadap dosis iradiasi sinar gamma lebih rendah dibandingkan dengan plantlet. Lethal dose 50 LD 50 untuk iradiasi plb berkisar antara 34.40 – 47.71 Gy. Lethal dose 50 LD 50 untuk iradiasi plantlet berkisar antara 36.58 Gy – 50.74 Gy. 3. Iradiasi sinar gamma pada plantlet S. plicata telah berhasil mendapatkan 9 mutan potensial 0.36 berdasarkan perbedaan bentuk dan warna daun serta bentuk dan warna bunga. Pengelompokan 9 tanaman mutan dan 3 kultivar anggrek S. plicata sebagai pembandingnya lebih akurat dan lebih efisien menggunakan marka ISSR dibandingkan dengan marka morfologi. Saran 1. Untuk mempertahankan bahan tanam dalam bentuk plb maupun plantlet sebaiknya dilakukan sub kultur secara rutin 6 minggu sekali berselang seling antara medium yang menggunakan arang aktif dan tanpa arang aktif. 2. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui genotipe tanaman mutan perlu diuji menggunakan marka co-dominant. 3. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk perbanyakan klonal mutan- mutan yang sudah stabil menggunakan teknik perbanyakan lini klon plb, tapi menggunakan bahan tanam meristem tunas tanaman mutan. 4. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan uji selfing tanaman mutan M1 untuk mengetahui apakah tanaman mutan sudah seragam atau masih terjadi segregasi. DAFTAR PUSTAKA Abdullah TL, Endan J, Nazir M. 2009. Changes in Flower Development, Chlorophyl Mutation and Alteration in Plant Morphology of Curcuma alismatifolia by Gamma Irradiation. American Journal of Applied Sciences 6 7: 1436-1439. Ahloowalia BS. 1992. In vitro variation induced mutants in chrysanthemum. Mutation Breeding Newletter 39:6. Ahmad TA, Abbasi NA, Hafiz IA, Ali A. 2007. Comparison of sucrose and sorbitol as main carbon energy sources in micropropagation of Peach rootstock GF-677. Pak. J. Bot. 394 : 1269-1275. Aisyah SI, Aswidinnor H, Saefuddin A. 2009. Induksi mutasi stek pucuk Anyelir Dianthus caryophyllus Linn. melalui iradiasi sinar gamma. J. Agron. Indonesia 371:62-70. Albert B, D Bray, J Lewis, M Raff, K Robert, and JD Watson. 1994. Molecular Biology of Cell. Third Eddition. pp 341. Banerji BK, Datta SK. 1992. Gamma ray induced flower shape mutation in crisanthemum cv ‘Java’. J. Nuclear Agric. Biol. 212:73-79. Bechtel H, Cribb P, Launert E. 1982. The manual of Cultivated Orchid Species. Blanford Press. Poole Dorset U. K. 444 pp. Broertjes, C. 1972. Mutation breeding of Achimenes. Euphytica 21: 48-63. Boertjes C, van Harten AM. 1988. Applied Mutation Breeding for Vegetatively Propagated Crops. Elsevier. Amsterdam. 345 p. [BPS]. 2011. Produksi Tanaman Hias di Indonesia. http: www.bps.go.id . 11 Nopember 2011. [BPS]. 2012. Produksi Tanaman Hias di Indonesia. http: www.bps.go.id 20 Februari 2012. Brock RD. 1979. Mutation of Plant Breeding for Seed Protein Improvement. p. 43-45. In. Seed Protein Improvement in Cereals and Grain Legumes. Proc. Symp. IAEAFAOGSF, Neuherberg, BRD. IAEA, Vienna. Busey P, Banerji BK. 1993. Gamma ray induced somatic mutation in chrysanthemum cv. Kalyani Mauve. J. Nuclear Agric. Biol. 221:19-27. Busey P. 1980. Gamma ray dosage and mutation breeding in St. Augustinegrass. Crop Sci. 20 : 181-184. Busey P. 2001. Mutation studies on garden chrysanthemum : A review. Scientific Horticulture 7:159-199. Chahal GS, Gosal SS. 2003. Principles and Procedures of Plant Breeding. Biotechnological and Conventional Approaches. Narosa Publishing House. Cribb PJ, Tang CZ. 1982, Spathoglottis Orchidaceae in Australia and the Pacific Islands. Kew Bulletin. 364: 721-729. Datta SK, Chakrabarty D. 2009. Management of Chimera and In Vitro Mutagenesis for Development of New Flower ColorShape and Chlorophyll Variegated Mutants in Chrysanthemum. Q.Y. Shu ed., Induced Plant Mutations in the Genomics Era. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome. 303-305. Datta SK, Steiner ML. 2005. In vitro mutagenesis a quick method for establishment of solid mutant in crhysanthemum. Curr. Sci., 88:155-158. Datta SK. 2001. Mutation studies on garden chrysanthemum : A review. Scientific Horticulture 7:159-199. Davis RS, Steiner ML. 1982. Philippine Orchids. Entrient Press. Attlagmalolos. Bulacan. 270 hlm. Decruse SW, Gangaprsat A, Seeni S, Menon S. 2003. Microprogation and ecorestoration of Vanda spathulata, an exquisite orchidase. Plant Cell, Tisuue and Organ Culture. 72 : 199-202. [Dirjen Hortikultura Deptan]. 2011. Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis: Anggrek. http:agri-research.or.idspecialkomoditasb3anggrek , 12 januari 2012 Dwiatmini K, Kartikaningrum S, Sulyo Y. 2009. Induksi mutasi Kecombrang Etlingera elatior menggunakan iradiasi sinar gamma. J. Hort 191:1-5 Donini B, Micke A. 1984. Use of Induced mutations in improvement of vegetatively propagated crop. IAEA-TECDOK-305:79-96. Engle LM. 1993. Germplasm collection strategies. In: Germplasm collection, evaluation, documentation, and conservation. AVRDC, Shanhua, Taiwan, ROC. Pp:2336. Fadelah AA. 2006. Breeding for tropical miniature pot Dendrobium orchids. Acta Hortic ISHS 714:51-58. Ferreira WM, Kerbauy GB, Kraus JE, Pescador R, Suzuki RM. 2006. Thiadiazuron influences the endogenous levels of cytokinins and IAA during the flowering of isolated shoots of Dendrobium. J Plant Physiol 163:1126 –1134 Gan S, Amasino RM. 1995. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science. 270:1986-1988. Gao S, Zang LQ, Zhang Y, Wang C, Song W, Han S. 2006. Application of ISSR markers to fingerprinting of elite cultivars varietiesclones from different sections of the Populus L. Sil Gen 551:788-795. Guo HB, Huang KY, Zhou TS, Wu QH, Zhang YJ, Liang ZS. 2009. DNA isolation, optimization of ISSR-PCR system and primers screening of Scutellaria baicalensis . Journal of Medicinal Plants Research Vol. 311: 898-901 Gupta PP, Schieder O, Gupta M. 1984. Intergeneric nuclear gene transfer between somatically and sexually incompatible plants through asymmetric protoplas fusion. Molecular and General Genetic 197:30-35 Handoyo F, Prasetya R. 2006. Native Orchids of Indonesia. Indonesian Orchid Society of Jakarta PAI Jakarta. Harris JG, Harris MW. 2004. Plant Identification Terminologi. Spring Lake Publishing. Utah Hartatik. 2000. Studi Genetik Plasma Nutfah Tebu Saccharum spp. Berdasarkan penanda Morfologi, Agronomi dan Isozim. Tesis Program Pascasarjana IPB Bogor. 138pp Hawkes AD. 1970. Eucyclopedia of Cultivated Orchids. Faber and Faber Limited, London. Hee KH, Loh CS, Yeoh HH. 2009. Early in vitro flowering and seed production in culture in Dendrobium Chao Praya Smile Orchidase. Plant Cell Rep. 26 : 2055-2062 Herison C, Rustikawati, Sutjahjo SH, Aisyah SI. 2008. Induksi mutasi melalui iradiasi sinar gamma terhadap benih untuk meningkatkan keragaman populasi dasar jagung Zea mays L.. J. Akta Agrosia 111:57-61 Hidayat EB. 1995. Anatomi Tumbuhan Berbunga. Bandung. Institut Teknologi Bandung Holtum RE. 1972. Flora of Malaya. Vol. I Orchid. Gov. Printing Office. Singapore. 759 pp Human S. 2003. Peran iptek nuklir dalam pemuliaan tanaman untuk mendukung industri pertanian. Puslitbang Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional BATAN, Jakarta. [IAEA]. 1977. Manual on Mutation Breeding, 2 nd edition. Tech. Report Series No.119. Joint FAOIAEA. Vienna: Div. of Atomic Energy in Food and Agriculture. 286 p. Ismachin M. 2007. Ilmu Pemuliaan Mutasi Materi Diklat BATAN. Jakarta. Jones DL. 2006. A Complete Guide to Native Orchids of Australia Including the Island Territories. Reed New Holland, Sydney. Kamemoto H, Amore TD, Kuehnle AR. 1999. Breeding Dendrobium orchids in Hawaii. University of Hawaii Press. Honolulu. Kartikaningrum S, Effendie K, Soedjono S, Widiastoety D, Hayati NQ, Prasetyo W. 2004. Koleksi dan Karakterisasi plasma nutfah anggrek Spathoglottis dan pemanfaatannya. In. Suhardi, T Sutater, Y Sulyo, Sabari dan Maryam Eds.. Prosiding Seminar Nasional Florikultur 4-5 Agustus 2004. Balithi bekerjasama dengan Dirjen Tanaman Hias, Asbindo dan Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor. Kartikaningrum S, Puspasari D. 2005. Keragaman Genetik Plasma Nutfah Anggrek Spathoglottis . J. Hort 154:260-269. Kartikaningrum S, Sulyo Y, Hayati NQ, Suryanah, Bety YA. 2007. Keragaan karakter kualitatif hasil persilangan anggrek Spathoglottis. J Hort. Edisi Khusus 2: 138-147. Kenyo A, Murdaningsih HK, Herawati T, Darsa JS. 2002. Tanggap dua kultivar Lili terhadap kombinasi komposisi medium MS dan gula pasir untuk konservasi in vitro . Zuriat 132 : 87-96. Kheawwongjun J, Thammasiri K. 2003. Breeding Spathoglottis spp. For commercial potted orchids http:www.publish.csiro.aupaperBT9930553.htm. Latest taxonomic scrutiny: Govaerts R., 11-Nov-2003 [Kominfo-Newsroom]. 2009. Anggrek Impor. http:www.depkominfo.go.id beritabipnewsroompasar-indonesia-didominasi-anggrek-impor Berita Pemerintahan 9 Juli 2009 Kumar P. 2009. Potential of molecular markers in plant biotechnology. Review Article. Plant Omics J, 24:141-162. Kuo HL, Chen JT, Chang WC. 2005. Efficient plant regeneration through direct somatic embryogenesis from leaf explants of Phalaenopsis ‘Little Steve’. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 41:453 –456 Lamseejan S, Jompok P, Wongpiyasatid A, Deeseepan S, Kwanthammachart P. 2000. Gamma-rays induced morfological change in Crysanthemum Crysanthemum morifolium. Kasetsart J. Nat. Sci. 34:417-422. Lapins KO. 1974. Compact Stella sweet cherry introduced. Mutation Breeding News Letter. IAEA, 4:8-13. Marlin. 2005. Pembentukan rimpang mikro jahe Zingiber officinale Rosc. secara in vitro dengan pemberian Benzyl Amino Purine dan sukrosa. Jurnal Akta Agrosia. 82 : 70-73 Martin KP, Madassery J. 2006. Rapid in vitro propagation of Dendrobium hybrids through direct shoot formation from foliar explants, and protocorm-like bodies. Sci Hortic. 108:95 –99 Micke A, Donini B. 1993. Induced mutation. In : Hayward MD, Bosemark NO, Romagosa I, ed. Plant Breeding Principles and prospects. Chapman Hall. Pp 52-77. Micke A, Donini B, Maluszynski M. 1987. Induced mutations for crop improve- ment - a review. Trop. Agric. 64 4 : 259-278 Mok MC. 1994. Cytokinin : chemistry, activity and fuction. In Cytokinin and plant development an overview. M. Mok DWS, MC ed.. p.155-156. CRC. Boca raton, FL. Napoli CA, Beveridge CA, Snowden KC. 1999. Reevaluating concept of apical dominance and the control of axilarry bud outgrowth. Curr. Top. Dev. Biol. 44:127-169 Naumann CH, Underbrink AG, Sparrow AH. 1975. Influence if radiation dose on somatic mutation industion in Tradescantia. Rad. Res. 62:79-96 Nayak NR, Sahoo S, Patnaik S, Rath SP. 2002. Establishment of thin cross section TCS culture method for rapid micropropagation of Cymbidium aloifolium L. Sw and Dendrobium nobile Lindl Orchidaceae. Sci Hortic. 94:107 –116 Park SY, Murthy HN, Paek KY. 2002. Rapid propagation of Phalaenopsis from floral stalk-derived leaves. In Vitro Cell Dev Biol Plant 38:168 –172 Parker J. 1994. Tropical Orchidscapes. American Orchid Society Bulletin. p. 258- 264. Poespodarsono S. 1988. Dasar-dasar Ilmu Pemuliaan Tanaman. Pusat Antar Universitas dan Lembaga Sumberdaya Informasi. Bogor: IPB. Puspaningtyas DM, Mursidawati S, Sutrisno, Asikin J. 2003. Anggrek Alam di Kawasan Konservasi Pulau Jawa. LIPI Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor. Bogor. Ramirez-Parra E, Desvoyes B, Gutierrez C. 2005. Balance between cell division and differentiation during plant development. Int.J.Dev.Biol. 49:467-477. Robert L. 2009. Orchids of far north-eastern Queensland 1995-2003. http:commons.wikimedia.orgwikiLewis_Roberts_Orchids_of_far_north- eastern_Queensland . Diunduh pada tanggal 4 Sepetember 2009. Romeida, A. dan I. A. Susanti. 2004. Aklimatisasi anggrek silangan Dendrobium cv. Thampomas x cv. Taq. Hawaii pada beberapa taraf konsentrasi pupuk daun bioplasma dan jenis media tanam. Laporan penelitian tidak dipublikasi. Romeida A, Hidayanti T. 2005. Multiplikasi plantlet anggrek Dendrobium cv. Thampomas x cv. Taq. Hawaii pada beberapa taraf konsentrasi BAP dan Arang Aktif secara in vitro. Laporan penelitian tidak dipublikasi. Seeni S, Latha PG. 1992. Foliar regeneration of endangered Red Vanda Renanthera imschootiana Rolfe Orchidase.. Plant cell, Tissue and organ Culture 29 : 167-172. Seeni S, Latha PG. 2000. In vitro multiplication and ecorehabilitation endangered Blue Vanda. Plant cell. Tissue and organ Culture. 61 : 1-8. Sim GE, Loh CS, Goh CJ. 2007. High frequency early in vitro flowering of Dendrobium Madame Thong-In Orchidaceae. Plant Cell Rep. 26:383 –393 Simmonds W. 1979. Principles of Crop Improvement. Longman, London. 408 p. Soedjono S. 2003. Aplikasi mutasi induksi dan variasi somaklonal dalam pemuliaan tanaman. Jurnal Litbang Pertanian. 222:70-78 Soltis ED, Soltis SP, Doyle JF. 1998. Contributions of PCR-Based Methods to Plant Systematics and Evolution Biology. Molecular Systematics of Plants II DNA Sequencing. Massachussets. Kluwer Academic Publishers. Stoskopf NC, Tomes DT, Christie BR. 2009. Plant Breeding Theory and Practice. Colorado. Westview Press, Inc. Sutjahjo SH, Rustikawati, Aisyah SI. 2007. Perakitan kultivar unggul jagung toleran kemasaman: seleksi in vitro mutan iradiasi sinar gamma dan varian somaklon. Laporan penelitian. LPPM-IPB Thompson SA, Wright FW. 1995. Spathoglottis plicata Orchidaceae: new to dominica, another record from the lesser antiles. Caribbean J. Sci. 31 1-2:148-149. Tjitrosoepomo G. 2005. Morfologi Tumbuhan. Cetakan ke-15. Gadjah Mada University Press. Torres KC. 1989. Tissue Culture Techniques fos Horticultural Crops. An Avi Book. New York. 285p. Van Harten AM. 1998. Mutation Breeding, Theory and Practical Application. Press. Syndicate of the Univ. of Cambridge. UK. 353 p. Van Harten AM. 2002. Mutation breeding of vegetatively propagated ornamentals. In A vainstein ed. Breeding for Ornamentals: classical and Molecular Approaches. Kluwer Academic Press., Boston Waluyo R. 2001. Induksi mutasi krisan Dendranthema grandiflora Tzvelev melalui iradiasi planlet. Skripsi Jurusan Budidaya Pertanian, Institut Pertanian Bogor. 38 hal. tidak dipublikasikan. Wang GY, Xu ZH, Chia TF, Chua NH. 1997. In vitro flowering of Dendrobium candidum . Sci China Ser C 40:35 –42 Wang HZ, Feng SG, Lu JJ, Shi NN, Liu JJ. 2009. Phylogenetic study and molecular identification of 31 Dendrobium species using inter-simpel sequent repeat ISSR markers. Scientia Horticultura. 122:440-447. Weising K, Nybom H, Wolft K, Meyer W. 1995. DNA Finger Printing in Plants and Fungi. CRC Press. Inc. Boca Raton. 322 p Wongpiyasatid A, Roongtanakiat N. 1992. Effects of gamma iradiation on flower colors and types of perennial Portulaca grandiflora Hook., pp. 695 –704. In the 30th Kasetsart University Conference Proceedings, Bangkok, Thailand. Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat SSR anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20:176-183. LAMPIRAN Lampiran 1. Nilai koefisien keragaman genetik mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya berdasarkan analisis klustering UPGMA marka morfologi 14 9 Lampiran 2. Nilai koefisien keragaman genetik mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya berdasarkan analisis klustering SHAN – UPGMA menggunakan 10 marka ISSR. 150