INDUKSI MUTASI PLANLET ANGGREK

menggunakan medium steril di ruang kultur ke kondisi aerob menggunakan medium non steril di rumah kawat mengakibatkan kematian planlet mencapai 20 pada saat 1 bulan setelah diaklimatisasi. Tanaman mulai pulih kembali setelah bulan kedua dan pada bulan keempat sudah mulai terlihat adanya pertumbuhan anakan pada beberapa planlet yang diradiasi dosis rendah, sementara pada dosis tinggi pemulihan kondisi planlet menjadi semakin lama, bahkan planlet tidak mampu pulih pada dosis lebih dari 70 Gy. Persentase pertumbuhan dan perkembangan planlet setelah diradiasi selanjutnya diaklimatisasi di rumah kawat dengan paranet 45 disajikan pada Gambar 17. Gambar 17. Persentase pertumbuhan dan perkembangan planlet anggrek S. plicata setelah diradiasi dengan sebelas dosis iradiasi sinar gamma sampai 7 bsi. Jumlah anakan yang terbentuk sampai dengan 7 bsi mencapai 164 dibandingkan dengan jumlah planlet awal, artinya dari 250 planlet yang diaklimatisasi dihasilkan 410 tanaman pada kontrol tanpa iradiasi. Kematian tanaman mencapai 20 pada umur 1 bulan setelah aklimatisasi, berarti tanaman yang hidup sebanyak 200 planlet yang selanjutnya mampu menghasilkan anakan rata-rata 1 anakan per tanaman. Anakan mulai terbentuk pada umur 5 bulan setelah aklimatisasi. Selanjutnya tangkai bunga mulai terbentuk pada umur 6 bsi. Persentase tanaman membentuk tangkai bunga fluorescent pada perlakuan tanpa diradiasi mencapai 25 pada 6 bsi dan mencapai 38 pada 7 bsi. Tanaman yang diradiasi secara umum memperlihatkan terjadinya gejala menguning klorosis dimulai dari ujung daun terlihat pada umur 2 minggu setelah iradiasi msi, selanjutnya daun mulai mengering nekrosis pada 4 bsi dan mati pada 6 bsi. Planlet yang diberi perlakuan iradiasi sinar gamma dengan dosis 10 Gy memperlihatkan gejala kematian mulai dari 2 msi, kematian planlet mencapai 11.11. Kematian tanaman terus meningkat sampai 6 bsi hingga mencapai 40 dan tetap stabil sampai 7 bsi. Tanaman yang hidup setelah iradiasi mulai terlihat adanya tanda-tanda pemulihan yang ditandai dengan terbentuknya daun baru dan mulai terjadi pembengkakan pangkal batang membentuk kormus dan pada 6 bsi sudah terlihat adanya pertumbuhan anakan baru. Tanaman baru anakan dari M1V1 diberi kode M1V2 M1 adalah tanaman yang diradiasi sinar gamma, V2 adalah anakan tanaman yang diradiasi. Gejala yang sama juga diamati pada tanaman yang diradiasi dengan dosis 20 Gy dan 30 Gy. Planlet yang diradiasi dengan 20 Gy setelah diaklimatisasi, mati sebanyak 22.22 pada 2 bsi, kematian tanaman terus meningkat sampai 6 bsi yaitu mencapai 62.22, pada 7 bsi sudah tidak ada tanaman yang mati. Planlet yang diradiasi dengan dosis 30 Gy mulai menunjukkan gejala klorosis pada 1 minggu setelah iradiasi msi. Tanaman mulai mati sebanyak 17.59 pada 1 bsi. Kematian tanaman terus meningkat sampai 74.26 pada 6 bsi. Jumlah tanaman yang hidup tetap stabil pertumbuhannya sampai 7 bsi. Kematian planlet yang telah diradiasi akut menggunakan dosis lebih dari 40 Gy menyebabkankan kematian planlet 50, planlet hanya mampu bertahan hidup selama 2 bulan. Peningkatan dosis menjadi 50 Gy, planlet yang mati 70 pada 1 bsi. Paparan dosis yang lebih tinggi dari 50 Gy yaitu 60 - 100 Gy, tanaman mulai memperlihatkan gejala klorosis yang diikuti dengan nekrosis akut, sebagian besar tanpa bisa pulih kembali mulai dari 2 hari setelah iradiasi hsi. Daun mengalami nekrosis akut dan mati seluruhnya mulai dari 2 msi, sementara tanaman yang mampu bertahan hidup 95 setelah 1 bsi. Dosis iradiasi 80 Gy dan 90 Gy menyebabkan seluruh tanaman mati pada 1 bsi, terdapat fenomena yang menarik pada planlet yang diradiasi pada dosis 100 Gy, karena terdapat 1 tanaman yang mampu pulih, tumbuh dan berkembang menjadi tanaman setelah mengalami dormansinya selama 12 bsi Gambar 18. Gambar 18. Kurva hubungan dosis iradiasi sinar gamma dengan : a persentase planlet hidup, b persentase anakan baru, c persentase populasi akhir pada 7 bsi. Hasil analisis menggunakan program Best Curve Fit Analysis untuk persentase tanaman hidup menghasilkan bentuk kurva 3rd degree Polynomial Fit : y = 55.91+35.01x-0.01x 2 +0.0006x 3 . Berdasarkan persamaan tersebut diperoleh nilai LD 30 = 40.58 Gy, LD 50 = 50.74 Gy dan LD 70 = 60.18 Gy. Persentase jumlah anakan baru menghasilkan bentuk kurva Linear Fit : y = 56.65 – 0.67x. Berdasarkan persamaan tersebut diperoleh nilai LD 30 = 33.78 Gy. Persentase populasi akhir yang diamati pada 7 bsi didapatkan bentuk kurva 3rd degree Polynomial Fit : y = 61.85+10.85x-0.057x 2 +0.0004x 3 , diperoleh nilai LD 50 untuk persentase populasi akhir sebesar 36.58 Gy. Radiosensitivitas planlet, melalui pengukuran nilai LD 50 dihasilkan pada kisaran dosis iradiasi sinar gamma 36.58 Gy – 50.74 Gy. Diperkirakan pada dosis sekitar LD 50 akan mampu menghasilkan mutan potensial yang sangat beragam Gambar 18. Dosis LD 50 pada beberapa jenis tanaman merupakan dosis terbaik untuk mendapatkan mutan terbanyak Herison et al. 2008. Biasanya untuk keperluan perbaikan kecil sifat morfologi digunakan dosis rendah yaitu sekitar LD 30 . Untuk mendapatkan perubahan yang cukup besar seperti perubahan warna daun dan bunga beberapa spesies tanaman menggunakan dosis sekitar LD 50 , sementara perubahan besar seperti terjadinya mandul jantan, tanaman kerdil dilakukan iradiasi dengan dosis mencapai LD 70 Human 2003. Kematian tanaman disebabkan terjadinya kerusakan materi genetik di dalam sel. Saat terjadi paparan sinar gamma elektron yang dilepas sinar gamma mampu menghasilkan energi yang cukup untuk mengionisasi partikel di dalam sel. Proses ionisasi menghasilkan radikal ion positif dan elektron bebas. Elektron akan terjebak di dalam lingkungan polar di dalam sistem biologi, sehingga cukup waktu bagi ion radikal yang labil dan aktif untuk bereaksi dengan molekul lain atau masuk ke dalam susunan jaringan yang lebih dalam. Materi biologi umumnya banyak mengandung air. Elektron bebas dapat mempolarisasikan sejumlah molekul air menjadi elektron berair e - aq . Radikal bebas yang terbentuk dalam larutan lambat laun akan bergabung membentuk produk yang stabil, bila ada molekul oksigen satu biradikal, ia akan bereaksi dengan radikal bebas yang terbentuk karena iradiasi, menjadi radikal –peroksida yang sangat beracun bagi sel. Adanya oksigen akan mengubah dan memperbanyak produk sistem iradiasi Ismachin 2007. Materi biologi selalu mengandung jumlah air yang cukup banyak. Oleh karena itu, penyerapan sinar pengion, disamping berperan dalam proses fisika maka peran proses kimiapun perlu diperhitungkan sebagai penyebab kerusakan genotipe van Harten 2002. Karakterisasi Pertumbuhan Vegetatif Hasil analisis data kuantitatif menggunakan Uji F pada taraf 5 dihasilkan pengaruh yang berbeda nyata pada peubah tinggi tanaman, panjang daun dan lebar daun. Hasil analisis uji lanjut menggunakan UJBD 5 Tabel 9. Akibat iradiasi sinar gamma pada planlet terjadi perubahan morfologi fase vegetatif anggrek S. plicata. Perubahan positif antara lain terjadi peningkatan jumlah anakan pada mutan 6 50 Gy sebanyak 9 anakan per tanaman, lebih banyak dibandingkan dengan tanaman tipe liarnya yang biasanya hanya mempunyai 1-2 anakan saja. Tinggi tanaman berkurang hampir terjadi pada semua mutan. Penurunan tinggi tanaman berkisar antara 20.45 – 71.98. Tanaman terendah diamati pada mutan 4 60 Gy dengan tinggi hanya sekitar 34.8 cm atau terjadi penurunan sebesar 71.98 dibandingkan dengan tipe liarnya yang mampu mencapai tinggi 124.2 cm setelah dilakukan domestikasi, sementara di habitat aslinya tanaman mampu mencapai tinggi 196 cm Tabel 9. Panjang dan lebar daun juga terjadi penurunan ukuran dibandingkan dengan tipe aslinya. Penurunan panjang daun berkisar antara 4.24 - 66.37, sementara penurunan lebar daun berkisar antara 0.65 - 71.98. Ukuran daun terkecil panjang dan lebar daun terjadi pada mutan 4 60 Gy. Berdasarkan hasil analisis terhadap tinggi tanaman, panjang dan lebar daun telah didapat idieotipe baru yaitu tanaman kecil hasil iradiasi planlet dengan dosis 60 Gy mutan 4 yang lebih cocok di jadikan tanaman pot Tabel 9. Besarnya perubahan yang terjadi pada mutan 4, hasil iradiasi 60 Gy, lebih tinggi dari LD 50 , menyebabkan terjadinya perubahan genotipe dari heterozigot menjadi homozigot resesif. Diduga akibat iradiasi yang lebih tinggi dari LD 50 menyebabkan terjadinya delesi pada segmen DNA, yang dapat memberikan pengaruh yang sangat nyata dan kuat terhadap ekspresi fenotipe tanaman, diantaranya tanaman menjadi kecil. IAEA 1977 menyatakan bahwa hasil iradiasi dari tanaman yang memeiliki genotipe heterozigot dapat berubah menjadi homozigot resesif atau terjadi delesi memberikan pengaruh yang nyata dan kuat terhadap genotipe dan probabilitas kejadiannya tinggi. Selain itu, pada mutan 4 juga terjadi inaktifasi enzim flavanone 3-hydroxylase F3H yang berperan dalam biosintesis anthocyanin berbasis delphinidin yang menghasilkan warna ungu cerah pada anggrek S. plicata tipe standar, sehingga adanya substrat pembentukan anthocyanin hanya mampu membentuk senyawa naringenin chachone atau senyawa chalchone yang berwarna kuning cerah Tsuda 2004. Besarnya perubahan fenotipe yang terjadi pada mutan 4 dibandingkan dengan tipe liarnya diduga dapat pula terjadi sampai pada level kromosom atau terjadi perubahan besar. Perubahan yang terjadi akibat iradiasi dapat terjadi pada gen tunggal, terhadap sejumlah gen atau terhadap susunan kromosom Poepodarsono 1988. Mutasi terjadi karena adanya perubahan urutan sequent nukleotida DNA kromosom yang mengakibatkan terjadinya perubahan pada protein yang dihasilkan oleh tanaman van Harten 2002. Selain terjadi penurunan ukuran daun dan tinggi tanaman, terdapat pula fenomena yang menarik, yaitu terjadinya peningkatan tinggi tanaman menjadi 124.8 cm, panjang daun 90.98 cm dan lebar daun 4.65 cm pada mutan 3 50 Gy. Pertambahan panjang daun sangat signifikan dan berbeda nyata dibandingkan dengan tipe liarnya yang memiliki panjang daun 76.22 cm. Penambahan ukuran daun dan tinggi tanaman akibat iradiasi sinar gamma pada 50 Gy diduga terjadi perubahan gen resesif menjadi gen dominan. IAEA 1977 mengemukakan bahwa akibat iradiasi sinar gamma dapat merubah genotipe tanaman dari Aa menjadi AA atau A- dengan frekwensi lemah. Penelitian ini telah membuktikan bahwa perubahan tersebut dapat terjadi walaupun dengan kemungkinan yang sangat kecil yaitu 1 tanaman dari 2 500 tanaman yang diradiasi atau sebesar 0.04 Tabel 9. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa pemuliaan mutasi menggunakan iradiasi sinar gamma memberikan hasil yang positif dan memberikan peluang untuk menghasilkan beberapa mutan yang sangat bermanfaat dalam meningkatkan keragaman anggrek S. plicata. Frekuensi keberhasilan mendapatkan mutan yang diinginkan melalui induksi mutasi sangat rendah, tapi dengan meningkatkan jumlah populasi dan melakukan iradiasi pada dosis sekitar LD 50 dapat memperbesar frekuensi keberhasilan menghasilkan mutan harapan. Tabel 9. Perubahan karakter vegetatif tanaman M1V1 anggrek S. plicata pada 12 bsi. Tanaman Panjang daun cm Tinggi tanaman cm Lebar daun cm panjang daun Tinggi tanaman Lebar daun Bentuk daun Warna daun SpBa Wildtype 76.22 b 124.20 a 4.44 b 100 100 100 Jorong HK MUTAN 150 Gy 58.28 c 79.40 c 4.25 b 76.47 63.93 95.65 Jorong HT MUTAN 270 Gy 52.22 c 79.40 c 3.56 bc 68.51 63.93 80.12 Jorong HT-V MUTAN 350 Gy 90.98 a 124.80 a 4.65 b 119.36 100.48 104.64 Jorong HT MUTAN 460 Gy 25.63 e 34.80 d 1.71 d 33.63 28.02 38.52 lancelot HT MUTAN 5100Gy 44.40 cd 75.00 c 4.35 b 58.26 60.39 98.05 membulat HT MUTAN 650 Gy 54.24 c 77.50 c 4.41 b 71.16 62.40 99.35 Jorong HK MUTAN 740 Gy 36.22 d 72.80 c 2.42 c 47.52 58.62 54.41 Jorong HT MUTAN 830 Gy 65.84 bc 92.20 b 4.02 a 86.38 74.24 113.06 Jorong HT-V MUTAN 960 Gy 49.75 cd 80.00 bc 3.75 bc 65.27 64.41 84.37 Jorong HT-V SpBH 72.96 a 149.60 a 5.28a 95.73 120.45 118.80 Jorong HT S04 76.39 a 112.80 a 5.29a 100.23 90.82 119.08 Jorong HK Keterangan : Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata pada UJBD, α = 0.05. Warna daun HK = hijau kekuningan, HT = hijau tua, HT-V= hijau tua terdapat varietaga Perubahan negatif akibat iradiasi sinar gamma antara lain terjadi kematian tanaman pada iradiasi dosis tinggi. Sebagian besar tanaman mengalami gugur daun yang ditandai dengan terjadinya klorosis mulai dari ujung daun selanjutnya menjadi nekrosis sampai akhirnya daun akan gugur. Sebagian tanaman sudah tidak mampu membentuk daun baru maupun tunas baru sampai dengan 12 bsi, sementara bonggolnya kormus masih tetap hidup. Kejadian hasil mutasi yang seperti ini tidak dapat dikriteriakan hidup namun tidak dapat pula dikatakan mati, maka untuk fenomena ini dikatagorikan sebagai tanman dorman. Gambar 19. Perbedaan morfologi pada fase vegetatif anggrek S. plicata setelah diradiasi sinar gamma. a bentuk dan ukuran daun, b variegata hijau-ungu, c variegata hijau putih, d variegata hijau-kuning. Gambar 20. Perbedaan morfologi pada fase vegetatatif anggrek S. plicata setelah diradiasi sinar gamma. a kormus dorman, b kormus tumbuh setelah dorman, c-d penampilan mutan 5 100 Gy, e-f, penampilan mutan 6 dengan jumlah anakan yang banyak, g-n perbedaan tangkai daunpangkal batang anggrek S. plicata pada mutan 1,2,3,4,7,8,9. Terdapat fenomena yang menarik untuk iradiasi planlet dengan dosis 100 Gy, hampir semua planlet mati setelah 2 bsi sinar gamma, tetapi ada satu planlet yang mengalami dormansi sampai 11 bulan setelah diradiasi, pada bulan ke dua belas terdapat satu tunas yang mampu tumbuh menjadi tanaman utuh namun sampai dengan 28 bulan belum mampu membentuk bunga, walaupun demikian tanaman tersebut sudah mampu bermultiplikasi membentuk anakan baru yang mencapai 8 tanaman Gambar 20. Karakter kualitatif seperti bentuk dan warna daun juga terjadi perubahan. Perubahan bentuk daun dari lonjong menjadi lonjong membulat pada mutan 5 100 Gy, dan lonjong menyempit pada mutan 4 60 Gy. Hasil percobaan ini juga dapat diamati terjadinya daun variegata hijau-putih pada mutan 2 70 Gy, variegata hijau-kuning pada mutan 8 30 Gy dan mutan 9 60 Gy, variegata hijau- pink pada mutan 1 dan 3 50 Gy. Hasil penelitian ini telah mampu mendapatkan varian daun variegata, namun belum didapat daun variegata yang stabil baik warna, bentuk maupun polanya. Daun variegata umumnya terjadi pada saat daun masih muda, setelah dewasa hanya sebagian kecil daun saja yang variegata Gambar 19. Perubahan warna tangkai daun pangkal batang dan tunasanakan terjadi pada mutan 2, mutan 4, mutan 5, dan mutan 6 menjadi hijau, untuk mutan 1, mutan 7 dan mutan 9 tangkai daun dan tunas muda berubah menjadi ungu pucat. Warna tangkai daun dan tunas tetap ungu cerah dijumpai hanya pada mutan 3 Gambar 20. Karakterisasi Pertumbuhan Generatif Hasil uji F pada taraf α 5 terhadap 20 karakter kuantitatif fase generatif, didapatkan pengaruh dosis iradiasi sinar gamma yang berbeda nyata terhadap sepuluh karakter generatif, yaitu lebar bunga, panjang bunga, panjang petal, lebar petal, panjang sepal dorsal, jumlah bunga mekar bersamaan, panjang tangkai bunga fluorescent sampai bunga pertama, panjang tangkai bunga fluorescent total, jumlah bunga total dan lama mekar bunga. Hasil analisis menggunakan UJBD 5 dapat diketahui bahwa mutan 3 50 Gy menghasilkan bunga yang paling besar dan tangkai bunga fluorescent yang terpanjang dibandingkan dengan mutan lainnya dan tipe liarnya. Jumlah bunga mekar bersamaan paling banyak dan lama mekar bunga terlama diperoleh pada mutan 1 50 Gy. Hasil pengamatan kuantitatif karakter generatif diperoleh mutan terbaik pada 50 Gy atau sekitar LD 50, karena pada dosis sekitar LD 50 dihasilkan mutan positif yang sangat penting untuk memperbaiki kekurangan yang terdapat pada tipe liarnya, seperti, ukuran bunga, panjang tangkai bunga, lama mekar bunga dan jumlah bunga yang mekar bersamaan Tabel 10. Tabel 10. Perbedaan karakter fase generatif secara kuantitatif tanaman mutan hasil iradiasi sinar gamma M1V1 anggrek S. plicata dan pembandingnya pada 12 bsi. Tanaman 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 SpBA 3.84b 3.40b 2.02b 1.14b 2.02ab 0.94 1.98 0.86 1.36 1.45 Mutan 1 5.48 a 5.15a 2.74b 1.81ab 2.80 ab 1.61 2.53 1.18 1.58 1.76 Mutan 2 6.26a 5.34 a 2.84ab 1.26 ab 2.96ab 1.16 1.64 1.08 1.32 2.00 Mutan 3 6.62a 6.28a 3.28a 2.18a 3.32a 1.65 2.90 1.52 2.08 2.38 Mutan 4 3.97b 3.54b 2.10b 1.00 b 1.74 b 0.90 1.80 0.76 1.20 1.48 Mutan 7 4.54ab 4.36ab 2.26b 1.34ab 2.50ab 1.10 2.04 1.00 1.36 1.74 Mutan 8 5.48a 5.24a 2.86ab 1.76ab 2.82ab 1.26 2.62 1.12 1.72 2.34 Mutan 9 5.06a 5.04 a 2.66b 1.32ab 2.80ab 1.18 2.60 0.98 1.16 1.78 SpBH 3.87b 3.44b 2.06b 1.22b 2.80ab 1.18 2.60 0.98 1.16 1.78 S04 4.01b 3.79b 2.01b 1.20b 2.16 ab 1.12 2.08 0.90 1.21 1.44 Tanaman 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 SpBA 2.50d 55.40 b 69.90 c 18.70c 3.00 d 0.88 0.76 0.48 3.62 1.40 Mutan 1 6.75a 53.38b 94.50b 38.82b 11.67a 1.15 1.08 0.60 4.05 2.17 Mutan 2 4.87b 50.34b 89.65b 48.45a 5.67 b 1.18 0.90 0.40 4.46 1.38 Mutan 3 3.23cd 97.58a 138.8a 49.70a 5.76 b 1.52 1.60 1.14 4.06 2.30 Mutan 4 2.34d 19.44d 34.50 d 22.25c 4.30 c 0.74 1.00 0.46 2.58 1.24 Mutan 7 4.80b 39.30c 77.60bc 38.40b 6.20 b 1.04 0.88 0.40 3.18 1.62 Mutan 8 4.25b 49.30b 78.90 bc 34.85b 4.50 c 1.74 0.90 0.40 4.24 1.82 Mutan 9 2.05d 42.10d 67.80c 34.20 b 4.52 c 1.06 1.00 0.30 4.24 1.70 SpBH 1.80d 51.30b 80.32b 22.50c 2.40 d 1.06 1.00 0.30 4.24 1.70 S04 1.80d 58.40 b 63.70 c 22.10c 2.10 d 0.65 0.82 0.30 3.73 1.70 Keterangan : 1 = lebar bunga, 2 = panjang bunga, 3 = panjang petal, 4 = lebar petal, 5 = panjang sepal dorsal, 6 = lebar sepal dorsal, 7 = panjang sepal lateral, 8 = lebar sepal lateral, 9 = panjang coulom, 10 = panjang labellum , 11 = jumlah bunga mekar bersamaan, 12 = panjang tangkai fluorescent sampai bunga pertama, 13 = panjang tangkai bunga fluorescent total, 14 = jumlah bunga total, 15 = lama mekar bunga, 16 = lebar labellumapical lobe, 17 = panjang lateral lobe, 18 = lebar lateral lobe , 19 = panjang tangkai bunga, 20 = panjang bakal buah. Ukuran peubah cm. Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata pada UJBD, α = 0,05 Frekuensi terbentuknya tanaman mutan berdasarkan hasil seleksi bentuk dan warna bunga, sangat rendah yaitu 0.36 atau hanya didapat 9 mutan dari total sekitar 2 500 planlet yang diradiasi dengan sebelas dosis iradiasi sinar gamma. Tanaman mutan dihasilkan pada kisaran dosis iradiasi sinar gamma 30-100 Gy. Mutan terbanyak dan beragam didapatkan pada dosis sekitar LD 50 . Penamaan mutan dilakukan berdasarkan urutan kejadian dihasilkan tanaman mutan sebagai berikut : 1. Dosis iradiasi sinar gamma 30 Gy menghasilkan 1 mutan dari 250 planlet yang diradiasi atau 0.4. Tanaman mutannya diberi kode 8SpBa30 Mutan 8, terjadi perubahan bentuk petal dari rata menjadi bergelombang dan ukuran bunga menjadi lebih besar. Terdapat 3-4 bunga mekar bersamaan dan lama mekar bunga 3-5 hari. 2. Dosis iradiasi sinar gamma 40 Gy menghasilkan 1 mutan dari 250 planlet yang diradiasi atau 0.4. Tanaman mutannya diberi kode 7SpBa40 Mutan 7. Perubahan yang terjadi adalah warna sepal menjadi pink muda, terdapat 4 bunga mekar bersamaan, lama mekar satu bunga menjadi 4-6 hari. 3. Dosis iradiasi sinar gamma 50 Gy menghasilkan 3 mutan dari 250 planlet yang diradiasi atau 1.2. Tanaman mutannya diberi kode 1SpBa50 mutan 1, 3SpBa50 mutan 3 dan 6SpBa50 mutan 6. Perubahan yang terjadi pada mutan 1 adalah warna sepal dan petal menjadi gradasi warna kuning muda dengan pink cerah kemerahan, warna apical lobe menjadi pink kemerahan dan side lobe menjadi pink cerah, warna callus menjadi kuning muda bintik-bintik pink fanta, terdapat 6 - 7 bunga mekar bersamaan, lama mekar satu bunga menjadi 11-14 hari, jumlah tangkai bunga mencapai 4 tangkai bunga per tanaman. Perubahan yang terjadi pada mutan 3 adalah warna sepal dan petal menjadi warna kuning muda dengan bintik-bintik pink fanta, warna apical lobe pink fanta, side lobe dan kalus warna kuning cerah bintik-bintik merah cerah, terdapat 3-5 bunga mekar bersamaan, lama mekar satu bunga menjadi 5-6 hari, ukuran bunga menjadi lebih besar 1.5 kali, ukuran tangkai bunga menjadi lebih panjang. Perubahan yang terjadi pada mutan 6, antara lain jumlah anakan meningkat menjadi 8-11 anakan per tanaman, sampai umur 28 bsi tanaman mutan belum berbunga, pertumbuhan tanaman tidak tegak, tapi menyamping agak membentuk sudut sekitar 65 o semi tegak. 4. Dosis iradiasi sinar gamma 60 Gy menghasilkan 3 mutan dari 250 planlet yang diradiasi atau 1.2. Tanaman mutannya diberi kode 4SpBa60 mutan 4, 9SpBa60 mutan 9a dan 9SpBa60 mutan 9b. Perubahan yang terjadi pada mutan 4 sangat besar antara lain tinggi tanaman berkurang, daun mengecil, panjang tangkai bunga menjadi lebih pendek yaitu sekitar 19-23 cm, warna sepal, petal dan apical lobe menjadi kuning cerah, warna side lobe kuning cerah pada bagian ujung sementara pada bagian pangkal pink kemerahan, ukuran bunga menjadi lebih kecil, terdapat 2-4 bunga mekar bersamaan, lama mekar satu bunga menjadi 3-5 hari, jumlah tangkai bunga mencapai 2-3 tangkai bunga per tanaman, terjadi perubahan posisi tangkai bunga selain pada sisi bulb juga tumbuh pada bagian terminal tanamanujung kormus. Diantara semua mutan yang dihasilkan, mutan 4 merupakan mutan terkecil dan merupakan idiotipe baru dari anggrek S. plicata. Perubahan yang terjadi pada mutan 9a adalah warna sepal dan petal menjadi warna pink muda, warna side lobe dan apical lobe pink, bentuk apical lobe menggulung keatas. terdapat 4-5 bunga mekar bersamaan, lama mekar satu bunga menjadi 4-5 hari, sepal lateral bersatu saat bunga mekar 1-3 hari, dan baru membuka pada hari keempat. Perubahan yang terjadi pada mutan 9b, antara lain terjadi kehilangan resupinasiperpuntiran bunga, sehingga penampilannya mirip dengan S. ungiculata, namun mutan yang dihasilkan tidak stabil, karena pada anakan kedua M1V2 resupinasi kembali terjadi. 5. Dosis iradiasi sinar gamma 70 Gy menghasilkan 1 mutan dari 250 planlet yang diradiasi atau 0.4. Tanaman mutannya diberi kode 2SpBa70 Mutan 2. Perubahan yang terjadi pada mutan 2 antara lain warna sepal, petal, apical lobe dan side lobe menjadi pink sangat muda mendekati putih, jumlah bunga mekar bersamaan meningkat menjadi 4-5 bunga, lama mekar bunga menjadi 6 - 8 hari. Hasil pengamatan visual terhadap perubahan morfologi karakter kualitatif fase generatif mati pada 9 tanaman mutan dan tipe liarnya disajikan pada Gambar 21, 22, 23 dan 24. Jumlah mekar bunga secara bersamaan disajikan pada Gambar 21, bentuk dan warna bunga disajikan pada Gambar 22, bentuk dan warna labellum, callus dan coulom disajikan pada Gamar 23, sedangkan bentuk dan warna apical lo be disajikan pada Gambar 24. Gambar 21. Perbedaan jumlah bunga mekar bersamaan anggrek S. plicata dan 7 mutan hasil iradiasi sinar gamma. Gambar 22. Perbedaan bentuk dan warna bunga anggrek S. plicata dan 7 mutan hasil iradiasi sinar gamma. Gambar 23. Perbedaan bentuk dan warna labellum, callus dan coulom anggrek S. plicata dan 7 mutan hasil iradiasi sinar gamma. Gambar 24. Perbedaan bentuk dan warna apical lobe anggrek S. plicata dan 7 mutan hasil iradiasi sinar gamma. Perubahan fase generatif secara umum yang terjadi pada tanaman mutan bila dibandingkan dengan tipe liarnya, antara lain terdapat perubahan pada bentuk dan warna petal, sepal, apical lobe, side lobe, callus, lama mekar bunga, kelopak tangkai bunga dan panjang tangkai bunga. Deskripsi lengkap tanaman anggrek S. plicata dan mutannya dapat dilihat pada Lampiran 3-12. Hasil pengamatan terhadap bentuk dan warna bunga juga terlihat bahwa semakin tinggi dosis iradiasi sinar gamma, maka warna bunga akan semakin berkurang, sampai dengan dosis 70 Gy warna yang dihasilkan mendekati putih Gambar 25. Gambar 25. Model perubahan warna dan bentuk bunga mutan anggrek S. plicata akibat iradiasi sinar gamma. Perubahan warna bunga yang terdapat pada anggrek S. plicata akibat dipengaruhi oleh enzim yang aktif dan substrat yang tersedia. Tanaman anggrek memiliki substrat berupa dihydromyricetin dengan adanya enzim DFR dan ANS akan mengubahnya menjadi delphinidin. Aktifnya antosianin berbasis delphinidin akan menghasilkan warna pink sampai ungu pada tanaman anggrek. Semakin sedikit enzim yang tersedia warna bunga semakin memudarnya warna bunga atau terdpat korelasi yang positif antara warna bunga dengan aktivitas enzim seperti yang terdapat pada mutan 2, mutan 7 dan mutan 9. Memudarnya warna bunga secra tidak merata sehingga menghasil warna dasar pink muda dengan bintik-bintik ungu cerah pada mutan 3 serta dihasikan gradasi warna kuning muda dengan ungu cerah pada mutan 1. Perubahan warna bunga dari ungu cerah menjadi kuning pada mutan 4, diduga diakibatkan tidak aktifnya enzim flavanone 3-hydroxylase F3H yang akan merubah substrat dihydro kaemferol substrat penghasil warna kuning sampai orange pada bunga menjadi dihydroquercetin yang akan menghasilkan warna merah pada bunga, selain itu enzim flavonoid 3’5-hydroxylase F35H juga tidak aktif atau rusak akibat iradiasi sinar gamma, sehingga menyebabkan substrat dihydroquercetin, tidak mampu berubah menjadi dihydromyricein dan terjadi akumulasi senyawa naringenin, sehingga warna ungu cerah yang terdapat pada tanaman tipe liarnya tidak terbentuk pada mutan 4 yang berwarna kuning, seperti dijelaskan pada Gambar 26. Gambar 26. Lintasan umum biosintetik flavonoid yang berhubungan dengan warna bunga Tsuda 2004. naringenin Hasil penelitian ini sejalan dengan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Tsuda 2004, pada tanaman Petunia hybrida , perubahan warna bunga ungu cerah menjadi berbagai warna yang lebih muda bahkan mendekati putih dengan pola warna yang sangat banyak variasinya. Fenomena perubahan warna yang terjadi diakibatkan terjadinya ekspresi gen endogen akibat mengalami penurunan regulasi dari gen flavonoid 3-hydroxylase Gambar 26. Penelitian rekayasa genetik terhadap enzim pembungaan pada tanaman Nierembergia sp. kultivar Fairy Bells Patio warna biru cerah NPLB, Suntory Flowers, Ltd. dan kultivar Fairy Bells warna biru pucat NPB, Suntory Flowers, Ltd. menghasilkan warna biru sangat muda mendekati putih Ueyama 2006. Akibat iradiasi sinar gamma terjadi perubahan fase generatif, terutama bentuk dan warna bunga. Fenomena Perubahan bentuk dan warna bunga akibat iradiasi sinar gamma hasil penelitian ini juga terjadi pada tanaman krisan Datta dan Chakrabarty 2009, Datta et al. 2005, kecombang Dwiatmini et al. 2009, mawar Soedjono 2003, Portulaca grandiflora Wongpiyasatid dan Roongtanakiat 1992. Hasil Pengamatan Mikroskopis Akar dan Daun. Hasil pengamatan mikroskopis terhadap penampang melintang akar menujukkan bahwa terdapat korelasi antara akumulasi warna akar dengan warna bunga. Sel akar yang mempunyai pigmen warna ungu antara lain ditemukan pada mutan 1, mutan 3, mutan 6, mutan 7, mutan 8 dan mutan 9, sementara untuk mutan 2, mutan 4, mutan 5 tidak terdapat warna ungu, sel akar berwarna agak kekuningan. Hasil pengamatan pada pada stomata antara lain didapatkan ukuran stomata lebih kecil pada mutan 5, bentuk stomata yang oval ditemukan pada mutan 1 dan 5. Jumlah kloroplas pada sel penjaga juga terdapat perbedaan, jumlah sel kloroplas pada sel penjaga lebih sedikit dibandingkan dengan tipe liarnya dapat diamati pada mutan 2, mutan 4, mutan 5 dan mutan 9, sementara pada mutan 1, mutan 3 dan mutan 8 dihasilkan jumlah kloroplas yang banyak dan padat Gambar 27. Perubahan pada bentuk stomata dan jumlah sel kloroplas pada sel penjaga di duga akibat terjadinya perubahan genotipe level lokus yang sering terjadi setelah dilakukan iradiasi. Perubahan yang terjadi pada level genotipe telah dapat diamati dengan jelas perubahannya pada mutan-mutan yang telah dihasilkan dan secara nyata telah menunjukkan perbedaan yang nyata dibandingkan dengan tipe liarnya. Perlakuan induksi mutasi pada genotipe awal yang heterozigot mempunyai peluang yang lebih besar untuk menghasilkan mutan yang mudah terlihat fenotipe nyata berbeda IAEA, 1977. Gambar 27. Pengamatan mikroskopis 1 irisan melintang akar, 2 bentuk stomata pada permukaan bawah daun 3 jumlah sel kloroplas pada sel penjaga stomata. Kesimpulan Beberapa kesimpulan yang dihasilkan dari percobaan ini adalah : 1. Iradiasi sinar gamma 30-100 Gy pada planlet anggrek S. plicata telah menghasilkan 9 tanaman mutan. 2. Lethal Dose 50 LD 50 dapat dijadikan acuan untuk iradiasi planlet S. plicata guna mendapatkan populasi mutan terbanyak. LD 50 persentase tanaman hidup adalah 50.74 Gy, LD 50 persentase anakan baru adalah 33.78 Gy dan LD 50 persentase populasi akhir adalah 36.58 Gy. 3. Perubahan warna bunga akibat iradiasi sinar gamma adalah gradasi warna pink -kuning mutan 1, pink sangat muda muatan 2, kuning muda bintik- bintik pink fanta mutan 3, kuning cerah mutan 4. Perubahan warna petal menjadi lebih muda mutan 7. Perubahan bentuk mahkota menjadi bergelombang mutan 8, serta terjadi penyatuan sepal lateral mutan 9. Daftar Pustaka Aisyah SI, Aswidinnor H, Saefuddin A. 2009. Induksi mutasi stek pucuk Anyelir Dianthus caryophyllus Linn. melalui iradiasi sinar gamma. J. Agron. Indonesia 371:62-70. Banerji BK, Datta SK. 1992. Gamma ray induced flower shape mutation in crisanthemum cv ‘Java’. J. Nuclear Agric. Biol. 212:73-79. Bartley GE, Scolnik PA. 1995. Plant carotenoids: pigmen for protection, visual attraction, and human health. Plant Science 153:33-42. Cai YZ, Sun M, Corke H. 2005. Characterization and application of betalain pigments from plant of Amaranthaceae. Trends in Food Science and Technology. 16:370-376. Datta SK, Chakrabarty D. 2009. Management of chimera and in vitro mutagenesis for development of new flower colorshape and chlorophyll variegated mutants in chrysanthemum. Shu QY ed., Induced Plant Mutations in the Genomics Era. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome 303-305 Datta SK, Misra P, Mandal AKA. 2005. In vitro mutagenesis – a quick methodfor establishment of solid mutant in chrysanthemum. Current Science. 881: 155- 158. Dwiatmini K, Kartikaningrum S, Sulyo Y. 2009. Induksi mutasi kecombrang Etlingera elatior menggunakan iradiasi sinar gamma. J. Hort. 191:1-5. Findlay JWA, Dillard RF. 2007. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. AAPS Journal. 92:260-267. Finney DJ, Phillips P. 1977. The form and estimation of a variance function, with particular reference to radioimmunoassay. Appl. Stat. 26:312-320. Handoyo F, Prasetya R. 2006. Native Orchids of Indonesia. Indonesian Orchid Sosiety of Jakarta. PAI Jakarta. Herison C, Rustikawati, Sutjahjo SH, Aisyah SI. 2008. Induksi mutasi melalui iradiasi sinar gamma terhadap benih untuk meningkatkan keragaman populasi dasar jagung Zea mays L.. J. Akta Agrosia 111:57-61. Human, S. 2003. Peran iptek nuklir dalam pemuliaan tanaman untuk mendukung industri pertanian. Puslitbang Teknologi Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional BATAN, Jakarta. Ibrahim R. 1999. In vitro Mutagenesis in roses. [Phd. Thesis]. Applied Biological Sci.Cell and Gene Biotechnology Fac. Univ. Gent, Belgium. 162 p. [unpublished]. Ismachin M. 2007. Ilmu Pemuliaan Mutasi [Materi Diklat] BATAN. Jakarta Kartikaningrum S, Puspasari D. 2005. Keragaman Genetik Plasma Nutfah Anggrek Spathoglottis . J. Hort. 154:260-269. Kartikaningrum S, Sulyo Y, Hayati NQ, Suryanah, Bety YA. 2007. Keragaan karakter kualitatif hasil persilangan anggrek Spathoglottis. J Hort. Edisi Khusus 2:138-147. Lamseejan S, Jompok P, Wongpiyasatid A, Deeseepan S, Kwanthammachart P. 2000. Gamma-rays induced morfological change in Crysanthemum Crysanthemum morifolium. Kasetsart J. Nat. Sci. 34:417-422. Sastrosumarjo S, Yudiwanti, Aisyah SI, Sujiprihati S, Syukur M, Yunianti R. 2006. Sitogenetika. Satrosumarjo S ed. Bagian Genetika dan Pemuliaan Tanaman Departemen AGH Faperta IPB, Bogor. Soedjono S. 2003. Aplikasi mutasi induksi dan variasi somaklonal dalam pemuliaan tanaman. Jurnal Litbang Pertanian 222:70-78. Strack D, Vogt T, Schliemann W. 2003. Recent advances in betalain research. Phytochemistry 62:247-269. Talhinhas P, Leitao J, Neves-Martins J. 2006. Collection of Lupinus angustifolius L. Gemrplasm and characterization of morphological and molecular diversity. Genetic Resources and Crop Evolution 53: 563-578 Tjitrosoepomo G. 2005. Morfologi Tumbuhan. Cetakan ke-15. Gadjah Mada University Press. To KY, Wang CK. 2006. Ornamental and Plant Biotechnology Volume I : FloricultureMolecular breeding of flower color. Global Science Books. United Kingdom. Tsuda S, Fukui Y, Nakamura N, Katsumoto Y, Yonekura-Sakakibara K, Mizutani MF, Ohira K, Ueyama Y, Ohkawa H, Holton TA, Kusumi T, Tanaka Y. 2004. Flower color modification of Petunia hybrida commercial varieties by metabolic engineering. Plant Biotechnology 215, 377 –386. Ueyama Y, Katsumoto Y, Fukui Y, Mizutani MF, Ohkawa H, Kusumi T, Iwashita T, Tanaka Y. 2006. Molecular characterization of the flavonoid biosynthetic pathway and flower color modification of Nierembergia sp. Plant Biotechnology 23:19 –24. Van Harten AM. 2002. Mutation breeding of vegetatively propagated ornamentals. In Vainstein A ed. Breeding for Ornamentals: classical and Molecular Approaches. Kluwer Academic Press. Boston. Venkatachalam P, Jayabalan N. 1992. Analysis of leaf proteins in gamma rays induced mutants of Zinia. Crop Improv. 19:97-99. Winkel-Shirley B. 2001. Flavonoid biosinthesis : a colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Science 166:1087-1096. Wongpiyasatid A, Roongtanakiat N. 1992. Effects of gamma radiation on flower colors and types of perennial Portulaca grandiflora Hook. pp. 695 –704. In. T the 30th Kasetsart University Conference Proceedings, Bangkok Thailand.

BAB VII. ANALISIS KERAGAMAN GENETIK ANGGREK

Spathoglottis plicata Blume. AKSESI BENGKULU DAN MUTAN HASIL IRADIASI SINAR GAMMA MENGGUNAKAN PENANDA MORFOLOGI DAN MOLEKULER GENETIC DIVERSITY ANALYSIS OF Spathoglottis plicata Blume. ORCHID ACCESSION BENGKULU USING MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR MARKERS Abstract Gamma-ray irradiation of 30 to 100 Gy using Spathoglottis plicata Blume. orchid clones have produced 9 mutants based on the shape and color of flowers. The objectives of experiments were to identify genetic variations of orchids S. plicata and its mutants using morphological characters and ISSR markers. Morphological characterization was conducted by applying the Desriptor and Characterization list from BALITHI-Deptan. Molecular identification was done by using ten ISSR primers of PKBT IPB collection. Morphological characters and ISSR markers could be used to identify the mutants. The result of clustering analysis and principal component analysis using morphological characters with 177 sub characters produced five main groups of 12 accessions and mutants at 0.68 coefficient similarity with the goodness of fit correlation matrix value reached to 0.89 suitable. The amplified product of 10 ISSR primers produced 360 bands, where 71 ISSR of loci 91.11 was polymorphic. The coefficient similarity and principal component analysis produced five major groups at 0.68 coefficient similarity and the goodness of fit correlation matrix value reached 0.91 very suitable. Keywords : Spathoglottis plicata, orchid, ISSR, mutant, gamma irradiation, morphological marker Pendahuluan Karakterisasi tanaman dapat dilakukan menggunakan penanda morfologi maupun penanda molekuler. Karakterisasi berdasarkan penanda morfologi biasanya dipengaruhi oleh lingkungan makro dan mikro. Kesulitan dapat terjadi apabila dilakukan untuk karakter yang bersifat kuantitatif yang dikendalikan oleh banyak gen. Sebaiknya disamping melakukan karakterisasi morfologi untuk karakter kualitatif, juga dilakukan karakterisasi menggunakan penanda molekuler. Penanda molekuler dapat memberikan gambaran hubungan kekerabatan yang lebih akurat antara suatu spesies dengan kerabat dekat maupun kerabat jauhnya serta antara suatu spesies dengan mutannya, karena analisis DNA sebagai materi genetik tidak dipengaruhi oleh lingkungan Liu et al. 2006. Pengambilan sampel DNA dapat dilakukan pada semua bagian tanaman Trojanowska dan Bolibok 2004. Penanda molekuler Inter Simple Sequence Repeats ISSR merupakan salah satu penanda dengan motif sekuen berulang. Ada kalanya terdapat penambahan sekuen nukleotida baik bagian ujung 3’ maupun ujung 5’. ISSR adalah fragmen DNA dengan ukuran 100-3 000 bp berlokasi diantara wilayah mikrosatelit, wilayah amplifikasi sekuen DNA yaitu ISSR bagian flanked genom secara berlawanan area yang dekat dengan sekuen berulang Zietkiewicz et al. 1994. Area amplifikasi dapat dilihat Gambar 28. Gambar 28. Wilayah amplifikasi ISSR Zietkiewicz et al. 1994. Keuntungan penggunaan marker molekuler, khususnya ISSR antara lain 1 tidak dipengaruhi musim dan lingkungan Azrai 2005, 2 tidak diperlukannya data sekuen terlebih dahulu, 3 membutuhkan 5-50 ng templat DNA per reaksi, 4 ISSR tersebar diseluruh genom 5 dapat menghasilkan pola polimorfisme lebih tinggi dari RAPD pada beberapa tanaman Liu et al. 2008, 6 menghasilkan polimorfisme tingkat inter species Zietkiewicz et al. 1994, 7 bersifat dominan Soltis et al. 1998, Kumar et al. 2009, 8 dapat digunakan untuk analisis keragaman genetik dan analisis kekerabatan Trojanowska dan Bolibok 2004. Percobaan ini bertujuan untuk : 1 mengidentifikasi dan mengkarakterisasi keragaman genetik anggrek S. plicata SpBA dan mutan hasil iradiasi sinar gamma menggunakan penanda morfologi, 2 menidentifikasi dan mengkarakterisasi keragaman genetik anggrek S. plicata SpBA dan mutan hasil iradiasi sinar gamma menggunakan molekuler ISSR, 3 menganalisis kemiripan antara mutan dengan tipe liarnya dan 4 mempelajari hubungan filogenetik antara tipe liar wild tipe anggrek S. plicata dengan 9 mutannya. Bahan dan metode Waktu dan Tempat Karakterisasi morfologi tanaman anggrek S. plicata dilakukan di rumah kawat dengan naungan 45 standar pemeliharaan anggrek tanah di Cibanteng Bogor mulai dari bulan Juli 2009 – Februari 2012. Karakterisasi molekuler menggunakan marka ISSR dilakukan di Pusat Kajian Buah-buahan Tropika LPPM IPB, mulai dari bulan November 2011 –Februari 2012. Metode Percobaan Sampel tanaman yang digunakan dalam percobaan ini sebanyak 12 genotipe yang terdiri dari 9 mutan hasil iradiasi sinar gamma dan 3 cv. anggrek S. plicata sebagai pembanding. Dua spesies berasal dari Kabupaten Kepahiang Provinsi Bengkulu diberi kode SpBA dan SpBH dan 1 spesies berasal dari Balithi Segunung diberi kode S04. Tanaman anggrek S. plicata dan mutan harapan yang digunakan sebagai sampel untuk analisis marka morfologi dan marka ISSR disajikan Tabel 11. Tabel 11. Daftar mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya yang dikarakterisasi secara morfologi dan molekuler ISSR. Kode Sampel Asal Tanaman Stabil sampai tanaman Keterangan SpBA Kepahiang Bengkulu M1V6 S. plicata batang ungu, bunga ungu wild tipe. Mutan1 1SpBA50 SpBA M1V6 Dosis Iradiasi 50 Gy Mutan 2 2SpBA70 SpBA M1V3 Dosis Iradiasi 70 Gy Mutan 3 3SpBA50 SpBA M1V3 Dosis Iradiasi 50 Gy Mutan 4 4SpBA60 SpBA M1V6 Dosis Iradiasi 60 Gy Mutan 5 5SpBA100 SpBA M1V2 Dosis Iradiasi 100 Gy Mutan 6 6SpBA50 SpBA M1V2 Dosis Iradiasi 50 Gy Mutan 7 7SpBA40 SpBA M1V2 Dosis Iradiasi 40 Gy Mutan 8 8SpBA30 SpBA M1V2 Dosis Iradiasi 30 Gy Mutan 9 9SpBA60 SpBA M1V2 Dosis Iradiasi 60 Gy SO4 Balithi Segunung M1V6 S. plicata cv.Alba batang hijau bunga putih SpBH Kepahiang Bengkulu M1V6 S. plicata batang hijau bunga ungu Analisis Penanda Morfologi Pengamatan karakter morfologi dilakukan pada fase pertumbuhan vegetatif dan fase generatif terhadap 12 genotipe tanaman anggrek S. plicata dan mutannya. Tanaman yang menghasilkan warna dan bentuk bunga yang berbeda dari tipe liarnya dipisahkan dan diberi kode khusus. Apabila warna bunga ataupun bentuk bunganya berbeda dibandingkan dengan tipe liarnya dan stabil mulai dari M1V1 sampai dengan M1V3 maka dapat dimasukkan kedalam kelompok tanaman mutan harapan. Karakter morfologi sebanyak 70 karakter yang diamati meliputi data akar, kormus, daun, bunga dan buah, menggunakan panduan karakterisasi anggrek Balithi 2007, seperti disajikan Tabel 12. Tabel 12. Karakter morfologi anggrek S. plicata dan mutan hasil iradiasi sinar gamma. Organ No Karakter Pengamatan Tanaman 1. Tipe pertumbuhan simpodial pola pertumbuhan anakan pada kormus 2. Ukuran tanaman kecil 50 cm, sedang 50-100 cm, besar 100 cm tanaman sudah tumbuh sempurna Kormus 3. Bentuk penampang bujur kormus eliptic, sircular kormus segar setelah dibuang daunnya 4. Bentuk penampang melintang kormus circular kormus segar setelah dibuang daunnya 5. Ukuran kormus kecil 2 cm, sedang 2-3 cm, besar 2 cm kormus segar setelah dibuang daunnya 6. Tipe pertumbuhan anakan pada kormus 2 arah kormus segar setelah dibuang daunnya 7. Tipe pertumbuhan daun pada kormus 2 arah kormus segar setelah dibuang daunnya 8. Tipe pertumbuhan tangkai bunga pada kormus pada pangkalsisi pseudobulb, ujung terminal kormus segar setelah dibuang daunnya 9. Ketegakan kormus tegak, semi tegak kormus segar setelah dibuang daunnya 10. Warna kormus hijau, hijau kecoklatan, hijau keunguan kormus segar setelah dibuang daunnya 11. Jumlah anakan per kormus 1=sedikit, 2 = sedang, 2 bangak kormus segar setelah dibuang daunnya Akar 12. Warna ujung akar 1cm dari ujung akar putih, kuning akar segar 13. Warna pangkal akar ungu tua, ungu cerah, putih akar segar 14. Irisan melintang akar ungu, kuning, putih akar segar 15. Bulu akar ada akar segar Daun 16. Penampang melintang daun plicate daun mekar sempurna 17. Daun muda variegata putih kekuningan, normal daun mekar sempurna 18. Warna daun tua hijau tua, hijau tua variegata, hijau kekuningan daun mekar sempurna 19. Warna batang semutangkai daun ungu, hijau daun mekar sempurna 20. Bentuk daun lonjong lebar, lonjong membulat , lonjong sempit daun mekar sempurna 21. Bentuk ujung daun apiculate daun mekar sempurna 22. Ujung daun simetris daun mekar sempurna 23. Bentuk tepi daun sinulateberliuk, rata daun mekar sempurna 24. Daun menjuntai, tegak daun mekar sempurna 25. Ukuran daun panjang, sedang, pendek daun mekar sempurna 26. Tulang daun sejajar sampai pangkal batang sejajar daun mekar sempurna Organ No Karakter Pengamatan 27. Warna tunas hijau, hijau keunguan, ungu cerah daun mekar sempurna 28. Tekstur permukaan daun gundulglabraus daun mekar sempurna Bunga dan buah 29. Warna tangkai bunga hijau keunguan, ungu cerah, hijau tangkai bunga 2 cm 30. Tipe pembungaan racemoseracemetandan Bunga pertama sudah mekar 31. Resupinasi putik ada Bunga pertama sudah mekar 32. Resupinasi bunga setelah mekar ada Bunga pertama sudah mekar 33. Perhiasan bunga terdiri dari 3 sepal 2 petal Bunga pertama sudah mekar 34. Sepal lateral normal, bersatu sampai bunga mekar dua hari bunga mekar sempurna 35. Bentuk bunga semi bulat, bintang bunga mekar sempurna 36. Bentuk sepal dorsal dan lateral spatulate, oblong bunga mekar sempurna 37. Bentuk petal elliptic datar, bergelombang bunga mekar sempurna 38. Bentuk ujung sepal dan petal acutemenajam keujung bunga mekar sempurna 39. Penampang melintang sepal dan petal datar, convexrecunvingcekung bunga mekar sempurna 40. Bentuk kelopak tangkai bunga hati, ellips bunga mekar sempurna 41. Ukuran kelopak tangkai bunga kecil, sedang, besar bunga mekar sempurna 42. Jumlah tangkai bunga tumbuh bersamaan per kormus 1, 2, 2 bunga mekar sempurna 43. Jumlah bunga mekar bersamaan 3bunga, =3bunga, 3bunga bunga mekar sempurna 44. Tipe tonjolan callus pada bibir complex bunga mekar sempurna 45. Spurtaji ada bunga mekar sempurna 46. Jumlah polinia 8 bunga mekar sempurna 47. Warna mahkota bunga ungu cerah, pink cerah, pink muda, pink sangat muda medekati putih, kuning cerah, kuning muda, putih bunga mekar sempurna 48. Warna sepal dorsal dan lateral ungu cerah, pink cerah, pink muda, pink sangat muda mendekati putih, kuning cerah, kuning muda, putih bunga mekar sempurna 49. Warna bunga polos, gradasi pink cerah kuning muda, bintik pink cerah pink sangat muda, pink muda sepal ungu cerah petal bunga mekar sempurna 50. Warna bunga1warna, 2 warna bunga mekar sempurna Organ No Karakter Pengamatan 51. Warna keping sisiside lobelateral lobe ungu cerah, merah, kuning, putih, pink muda, pink sangat muda bunga mekar sempurna 52. Warna side lobe 1warna, 2 warna bunga mekar sempurna 53. Warna keping tengahmid lobeapical lobe ungu cerah, pink kemerahan, pink muda keunguan, pink fanta, kuning cerah, pink, pink keunguan, putih bunga mekar sempurna 54. Warna kalustonjolan pada bibir kuning cerah, kuning muda, pink sangat muda bintik ungu, kuning cerah bintik merah, kuning cerah bintik ungu cerah bunga mekar sempurna 55. Warna kalus 1 warna, 2 war,na bunga mekar sempurna 56. Warna coulomb merah, pink muda, ungu cerah, pink tua, kuning cerah, putih bunga mekar sempurna 57. Warna taji kuning cerah, kuning muda, putih bunga mekar sempurna 58. Mahkota dan sepal saat bunga mekar tidak terbuka lebar, terbuka lebar bunga mekar sempurna 59. Warna bakal buah ungu tua, ungu kehijauan, hijau keunguan, hijau bunga mekar sempurna 60. Warna tangkai bunga ungu cerah, ungu kehijauan, pink keunguan, ungu kecoklatan, hijau, hijau kekuningan bunga mekar sempurna 61. Warna buah tua hijau tua, hijau kekuningan, hijau kecoklatan, hijau keunguan buah berkembang sempuna 62. Bentuk bunga bintang, bintang membulat bunga mekar sempurna 63. Bentuk petal cekung pinggir rata, cekung pinggir bergelombang bunga mekar sempurna 64. Bentuk petal eliptic bunga mekar sempurna 65. Bentuk sepal dorsal eliptic, ovate bunga mekar sempurna 66. Bentuk apical lobe obovate, deltoid, obovate transverse bunga mekar sempurna 67. Ukuran apical lobe medium, shallow bunga mekar sempurna 68. Bentuk apical lobe datar, melengkung keatas, melengkung kebawah bunga mekar sempurna 69. Ukuran bunga kecil diameter 4 cm, sedang diameter 4 cm, besar diameter 4 cm bunga mekar sempurna 70. Lama mekar bunga bersamaan 3hari, 3- 4 hari, 4hari bunga mekar sempurna Analisis Penanda Molekuler menggunakan ISSR Isolasi DNA DNA genom total diisolasi dari daun muda menggunakan metode cetyl trimethyl ammonium bromide CTAB yang telah dilakukan optimasi oleh Sá et al. 2011, dengan penambahan antioksidan polyvinyl pyrrolidone PVP, 1,4- dithiothreitol DTT dan 2-mercaptoethanol. Sampel daun muda segar ditimbang sebanyak 0.3 g dari masing-masing bahan tanaman, dihancurkan menggunakan mortar yang di dalamnya ditambahkan buffer ekstrak yang terdiri dari 3 CTAB, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 1.5 NaCl, 1 β-mercaptoethanol dan 1 Polyvinylpyrolidone PVP, kemudian diinkubasi dalam waterbath suhu 65 C selama 30 menit. Setelah diinkubasi, ditambahkan larutan Chloroform-isoamyl alkohol CIA 24:1 sebanyak 1 kali volume kemudian divortex selama 1 menit hingga larutan tercampur. Sampel disentrifusi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 10 menit dengan tujuan untuk memisahkan bagian DNA dan bahan-bahan lainnya. Supernatan dimasukan ke dalam tabung baru dan ditambahkan CIA kembali sebanyak 1x volume dan disentrifuse kembali. Supernatan ditambahkan isopropanol sebanyak 1x volume. Larutan DNA tersebut disentrifusi kembali dan larutan di buang hingga pellet DNA tertinggal diujung tube, kemudian ditambahkan akohol 70 sebanyak 100 µl dan disentrifusi kembali. Alkohol dibuang dan pellet DNA dikeringkan dengan cara tube dibalik disimpan dalam desikator sampai pellet DNA mengering. Pellet DNA yang kering ditambahkan air bebas ion sebanyak 10 µl dan dijadikan sebagai stok DNA. Uji kualitas DNA total dilakukan dengan menggunakan larutan agarose 0.8 dan dielektroforesis dalam larutan buffer TAE 1x yang dialirkan arus listrik dari muatan negatif menuju muatan positif selama selama 50 menit dengan voltase 50 volt. Konsentrasi DNA total dapat diperkirakan berdasarkan hasil elektroforesis yaitu dengan cara membandingkan DNA total dengan lamda DNA. Lamda DNA yang digunakan produk merk promega. Lamda yang digunakan untuk mengecek konsentrasi DNA total dibutuhkan sebanyak 1µl dan diisikan lubang sumur pertama agarose. Konsentrasi Lamda DNA dalam 1 µl adalah 457 µg ml -1 . Volume DNA total untuk tes kualitas DNA digunakan sebanyak 5 µl, sehingga untuk setiap 1 µl DNA setara dengan 91.4 ng µl -1 . Kebutuhan DNA untuk tahapan PCR sebanyak 10 ng, maka DNA total diencerkan konsentrasinya menjadi 5x. Pewarnaan dengan cara perendaman gel agarose di dalam larutan Et-Br 1 selama 10 menit, kemudian didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital canon power shoot A480 penyinaran uv transilluminator. Elektroforesis ditujukan untuk pengecekan kualitas DNA total dan produk PCR. Analisis ISSR Primer yang digunakan adalah primer ISSR koleksi Laboratorium Pusat Kajian Buah Tropika LPPM IPB sebanyak 10 primer dengan kode PKBT dan ISSRED. Primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA genom anggrek S. plicata dan mutannya adalah primer ISSR yang sudah diuji melalui tahap optimasi suhu annealing di Laboratorium Pusat Kajian Buah Tropika Institut Pertanian Bogor Tabel 13. Tabel 13. Nama dan susunan basa primer ISSR koleksi PKBT-IPB. No Nama Primer Susunan Basa Suhu Annealing No Nama Primer Susunan Basa Suhu Annealing 1. PKBT 2 AC8TT 53 C 6. PKBT8 GA9C 54 C 2. PKBT 3 AG8T 53 C 7. PKBT9 GA9T 54 C 3. PKBT 4 AG8AA 53 C 8. ISSRED12 AGAC4 36 C 4. PKBT 6 AG8TT 53 C 9. ISSRED14 GAC5 48 C 5. PKBT 7 GA9A 54 C 10. ISSRED20 TCC5A 48 C Polymerase Chain Reaction PCR dilakukan dengan alat PCR merk Applied Biosystem 2 720 thermal cycler. Komposisi PCR meliputi : DNA 10 ng µ l -1 sebanyak 5 μl, primer 10 pmol µl -1 sebanyak 5 μl dan PCR mix 12.5 μl, kemudian ditambahkan air bebas ion hingga mencapai volume 25 μl. Tahapan siklus PCR dilakukan selama 35 siklus, meliputi pre heat 94 C, 4 menit, denaturation 94 C, 30 detik, annealing 36 C-53 C, 30 detik, extention 72 C, 1 menit, penurunan 72 C, 5 menit dan pendinginan 4 C, sampai tak terhingga. Analisis Data Data morfologi dan molekular dianalisis menggunakan program NTSYS-pc Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis versi 2.02i Rohlf 1998. Pengamatan pola pita DNA yang dihasilkan menggunakan marka ISSR setelah dilakukan elektroforesis untuk memisahkan lokus yang memiliki ukuran yang berbeda diberi nilai skor 1 apabila muncul pita dan dan nilai skor 0 apabila tidak muncul pita Liu et al. 2006. Pengamatan pita DNA berdasarkan konsistensi ketebalan pita DNA yang diamati. Angka biner dianalisis menggunakan program NTSYS-pc versi 2.02i. Metode pengelompokan menggunakan koefisien dice dari Similarity for Qualitative Data SIMQUAL dan Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested SAHN - Unweighted pair-group method arithmatic average UPGMA Soltis et al. 1998. Hasil analisis berupa plot dua dimensi dan karakter pendukung pengelompokan. Hasil pengelompokan berupa dendrogram yang memvisualisasikan hubungan genetik antar mutan dan tanaman pembanding yang digunakan. Tingkat keselarasan pengelompokan ditentukan oleh nilai goodness of fit yaitu kesesuaian antara nilai koefisien kemiripan SM dengan kriteria sangat sesuai r 0.9, sesuai 0.8 r 0.9, tidak sesuai 0.7 r 0.8 dan sangat tidak sesuai r 0.7 Wang et al. 2009. Analisis komponen utama menggunakan metode multivariate program MINITAB. Hasil dan Pembahasan Analisis Penanda Morfologi Keragaman morfologi yang dapat diamati pada mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya diperoleh sebanyak 70 karakter yang setara dengan lokus pada penanda molekuler. Selanjutnya dari setiap karakter diperoleh keragaman morfologi masing-masing karakter sebanyak 177 sub karakter yang setara dengan pita yang muncul pada analisis molekuler. Karakterisasi morfologi hasil pengamatan pada 12 genotipe mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya berdasarkan panduan karakterisasi Balithi 2007, disajikan pada Tabel 14. Tabel 14. Rekapitulasi karakter morfologi mutan anggrek S. plicata dan pembandingnya. No Karakter morfologi sub karakter morfologi Jumlah sub karakter Jumlah karakter polimorfik Jumlah karakter monomorfik 1. Tipe pertumbuhan simpodial 1 1 2. Ukuran tanaman kecil 50 cm, sedang 50-100 cm, besar 100 cm 3 3 3. Bentuk penampang bujur kormus eliptic, sircular 2 2 4. Bentuk penampang melintang kormus circular 1 1 5. Ukuran kormus kecil 2 cm, sedang 2-3 cm, besar 2 cm 3 3 6. Tipe pertumbuhan anakan pada kormus 2 arah 1 1 7. Tipe pertumbuhan daun pada kormus 2 arah 1 1 8. Tipe pertumbuhan tangkai bunga pada kormus pada pangkalsisi pseudobulb , ujung terminal 2 2 9. Ketegakan kormus tegak, semi tegak 2 2 10. Warna kormus hijau, hijau kecoklatan, hijau keunguan 3 3 11. Jumlah anakan per kormus 1=sedikit, 2 =sedang, 2 bangak 3 3 12. Warna ujung akar 1cm dari ujung akar putih, kuning 2 2 13. Warna pangkal akar ungu tua, ungu cerah, putih 3 3 14. Irisan melintang akar ungu, kuning, putih 3 3 15. Bulu akar ada 1 1 16. Penampang melintang daun plicate 1 1 17. Daun muda variegata putih kekuningan, normal 2 2 18. Warna daun tua hijau tua, hijau tua variegata, hijau kekuningan 3 3 19. Warna batang semutangkai daun ungu, hijau 2 2 20. Bentuk daun lonjong lebar, lonjong membulat , lonjong sempit 3 3 21. Bentuk ujung daun apiculate 1 1