BAB III METODE PENELITIAN
Metode yang digunakan adalah metode eksperimental meliputi pengumpulan dan pengolahan tumbuhan, pemeriksaan karakteristik, skrining
fitokimia, pembuatan ekstrak, kromatografi lapis tipis KLT dan uji aktivitas biologi ekstrak talus rumput laut Sargassum ilicifolium Turner C. Agardh
menggunakan larva Artemia salina Leach.
3.1 Alat-alat Yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, pipet tetes, kertas saring, aluminium foil, kaca penutup, kaca objek,
vial, bejana penetasan telur Artemia salina Leach, lampu 18 watt Hannochs, cawan berdasar rata, botol bersumbat, krusen tang,
seperangkat alat destilasi
,
seperangkat alat penetapan kadar air, cawan porselen, eksikator, mikroskop Olympus, oven listrik Stork, seperangkat alat kromatografi lapis tipis,
elektromantel EM 2000, neraca analitik Vibra AJ, dan penangas air Yenaco.
3.2 Bahan-bahan Yang Digunakan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah talus rumput laut Sargassum ilicifolium Turner C. Agardh, telur Artemia salina Leach ISO,
garam buatan, ragi, air suling.
Bahan-bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain berkualitas pro analisis yaitu n-heksan destilasi, etilasetat destilasi, etanol 96 destilasi,
asam asetat anhidrida, asam sulfat pekat, kloroform, toluen, timbal II asetat, amil alkohol, metanol, natrium hidroksida, asam klorida pekat, serbuk magnesium,
serbuk seng, kloralhidrat, isopropanol, natrium sulfat anhidrida, α-naftol, amonia
Universitas Sumatera Utara
pekat, besi III klorida, iodium, raksa II klorida, kalium iodida, bismut III nitrat, dan asam nitrat pekat.
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Umur tumbuhan yang diambil tidak
diperhitungkan. Tumbuhan yang digunakan adalah talus rumput laut Sargassum ilicifolium Turner C. Agardh yang diambil dari perairan pantai Poncan,
Kotamadya Sibolga, Propinsi Sumatera Utara dan dikumpulkan pada bulan Juli 2010.
3.3.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi – LIPI, Jakarta, Indonesia. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1,
halaman 41.
3.3.3 Pengolahan Simplisia
Talus rumput laut Sargassum ilicifolium Turner C. Agardh dibersihkan dari kotoran dan sisa-sisa karang yang melekat lalu dicuci dengan air mengalir
sampai bersih, ditiriskan dan disebar diatas kertas koran sehingga airnya terserap, lalu ditimbang berat basahnya 14 kg. Tumbuhan dikeringkan dengan cara diangin-
anginkan diudara terbuka. Selanjutnya dikeringkan dilemari pengering pada suhu 40-50ºC sampai tumbuhan kering. Talus dianggap kering bila sudah rapuh
diremas menjadi hancur, kemudian disortasi kering dan diperoleh berat 1,2 kg, lalu diblender sampai menjadi serbuk. Selanjutnya serbuk simplisia disimpan
dalam kantung plastik.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan.
3.5 Pembuatan Larutan Pereaksi
3.5.1 Larutan Pereaksi Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga
100 ml Ditjen POM, 1978. 3.5.2 Larutan Pereaksi Natrum Hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas
karbondioksida hingga 100 ml Ditjen POM, 1978. 3.5.3 Larutan Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling, ditambahkan iodium sebanyak 2 g dan dicukupkan dengan air suling
hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.4 Larutan Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain dilarutkan 5 g kalium iodida dalam 10 ml air suling. Kemudian
keduanya dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.5 Larutan Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut III nitrat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain dilarutkan 27,2 g kalium iodida dalam 50
ml air suling. Kemudian kedua larutan dicampurkan sama banyak dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan
air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1978.
Universitas Sumatera Utara
3.5.6 Larutan Pereaksi Besi III Klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml
Ditjen POM, 1989. 3.5.7 Larutan Pereaksi Liebermann- Burchard
Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 1 bagian asam sulfat pekat. Larutan penyemprotnya dibuat dengan 20 bagian asam asetat
anhidrida dengan 1 bagian asam sulfat pekat dan 50 bagian kloroform. Larutan
penyemprot ini harus dibuat baru Harborne, 1987. 3.5.8 Larutan Pereaksi Molisch
Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh volume 100 ml Ditjen POM, 1978.
3.5.9 Larutan Air-Kloroform
Sebanyak 2,5 ml kloroform dikocok dengan 900 ml air suling, encerkan dengan air suling hingga 1000 ml Ditjen POM, 1995.
3.5.10 Larutan Kloralhidrat
Sebanyak 50 gram kloralhidrat ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml air suling Ditjen POM, 1979.
3.5.11 Larutan Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 N
Sebanyak 15,17 gram timbal II asetat dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida secukupnya hingga 100 ml Ditjen POM, 1989.
3.5.12 Pereaksi Asam Nitrat 0,5 N
Sebanyak 3,4 ml asam nitrat pekat diencerkan dengan air suling hingga volume 100 ml Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara
3.5.13 Pereaksi Asam Sulfat 50 dalam Metanol
Sebanyak 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan hati-hati kepada 5 ml metanol Stahl, 1985.
3.6 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karateristik simplisia meliputi pemeriksan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam Ditjen POM, 1989; SNI, 1992;
WHO, 1992 .
3.6.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, warna, bau dan rasa talus rumput laut. Gambar simplisia Sargassum ilicifolium Turner
C Agardh dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 42-44.
3.6.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia talus rumput laut Sargassum ilicifolium Turner C Agardh. Serbuk simplisia
ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan tutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Gambar
mikroskopik dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 45.
3.6.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen WHO,1992.
Cara kerja: a.
Penjenuhan toluen
Universitas Sumatera Utara
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Kemudian toluen didinginkan selama 30
menit dan volume air pada tabung penerima dibaca dengan 0,05 ml. b.
Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan
ke dalam labu yang berisi toluen tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetesan
perdetik, sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan hingga 4 tetes perdetik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin
dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan dingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah
sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa.
Perhitungan kadar air dapat dihitung dengan rumus:
kadar air =
100 g
sampel Berat
ml air
Volume ×
Perhitungan penetapan kadar air dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 46.
3.6.4 Penetapan Kadar Sari Yang Larut Dalam Air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform dalam labu bersumbat
sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan
penguap berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung dengan persen terhadap bahan
yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
Perhitungan kadar sari yang larut dalam air dapat dihitung dengan rumus: Kadar sari larut dalam air =
20 100
simplisia berat
sari berat
×
x 100 Perhitungan kadar sari yang larut dalam air dapat dilihat pada Lampiran 4,
halaman 47.
3.6.5 Penetapan Kadar Sari Yang larut Dalam Etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat
sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol 96,
sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap berdasar rata yang telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105
O
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung dalam persen terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995. Perhitungan kadar sari yang larut dalam etanol dapat dihitung dengan rumus:
Kadar sari larut dalam etanol =
20 100
simplisia berat
sari berat
×
x 100 Perhitungan kadar sari larut dalam etanol dilihat pada Lampiran 4, halaman 48.
3.6.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 500–600
°C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
di udara Ditjen POM, 1995.
Universitas Sumatera Utara
Perhitungan kadar abu total dapat dihitung dengan rumus: Kadar abu total =
simplisia berat
abu berat
x 100 Perhitungan kadar abu total dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 49.
3.6.7 Penetapan Kadar Abu Yang Tidak Larut Dalam Asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang dikeringkan di udara Ditjen POM, 1995. Perhitungan kadar abu yang tidak larut asam dapat dihitung dengan rumus:
Kadar abu tidak larut dalam asam =
simplisia berat
abu berat
x 100 Perhitungan kadar abu yang tidak larut dalam asam dapat dilihat pada Lampiran 4,
halaman 50.
3.7 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoida, glikosida, glikosida antrakinon, saponin, tanin, dan
steroidtriterpenoida Ditjen POM, 1989; Farnsworth, 1966.
3.7.1 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, kemudian ditambah 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit.
Dinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut:
Universitas Sumatera Utara
a. Filtat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Mayer,
akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning bila terdapat alkaloida.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam bila terdapat alkaloida.
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes pereaksi Dragendorf akan
terbentuk warna merah atau jingga bila terdapat alkaloida. 3.7.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan saring dalam keadaan panas. Ke dalam 5 ml filtrat
ditambahkan serbuk Magnesium, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok kuat dan dibiarkan memisah.Bila terdapat flavonoida ditunjukkan dengan
timbulnya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
3.7.3 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok selama 10 detik. Jika
terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N bila adanya saponin.
3.7.4 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia, disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau hijau kehitaman bila adanya tanin.
Universitas Sumatera Utara
3.7.5 Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 1 jam, didinginkan
dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air dan 25 ml timbal asetat 0,4 M, dikocok, diamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran
isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan dalam tabung reaksi selanjutnya, diuapkan di
atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Tambahkan hati- hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuknya
cincin ungu pada batas kedua cairan bila adanya gula.
3.7.6 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya
ditambahkan 2 tetes Liebermann-Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah berubah menjadi ungu atau biru hijau bila adanya steroidatriterpenoida.
3.8 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan secara perkolasi menggunakan pelarut n- heksan, etilasetat dan etanol 96.
Cara kerja: Sebanyak 400 gram talus rumput laut Sargassum illicifolium Turner C.
Agardh yang telah diserbukkan dimasukkan ke dalam bejana tertutup, lalu direndam dengan cairan penyari selama 3 jam. Kemudian massa dimasukkan ke
dalam perkolator, lalu pelarut n-heksan dituang secukupnya sampai terdapat selapis larutan penyari diatas serbuk simplisia, mulut perkolator ditutup dengan
Universitas Sumatera Utara
plastik dan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Setelah 24 jam keran perkolator dibuka dan cairan perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 tetes
per detik dan ditampung dalam botol berwarna bening. Perkolasi dihentikan setelah tetesan terakhir perkolat tidak berwarna lagi atau apabila sebanyak 500 mg
cairan perkolat diuapkan di atas penangas air tidak meninggalkan sisa. Perkolat dipekatkan dengan bantuan alat penguap rotary evaporator pada temperatur tidak
lebih dari 40 C, lalu ampas dikeluarkan dari alat perkolator dan dikeringkan
dengan cara di angin- anginkan selama 1 jam. Perkolasi dengan penyari etil asetat dan etanol 96 dilakukan dengan cara yang sama. Bagan pembuatan ekstrak
dapat dilihat pada Lampiran 5, halaman 51.
3.9 Analisis Ekstrak
Kategori