Rancangan Penelitian METODE PENELITIAN

40 Gambar 6. Diagram alir penelitian Pelaksanaan Penelitian Penelitian yang akan dilakukan terdiri dari 5 tahapan. Tahap yang pertama peremajaan dan penyediaan stok ganggang mikro media BG 11. Tahap kedua yaitu kultivasi pada skala laboratorium dan di scale up pada skala lapang pada kolam kanal dalam media terpilih. Tahap ketiga pemanenan dan pengeringan. Tahap empat produksi biomassa ganggang mikro, tahap lima proses pembuatan etanol dari karbohidrat ganggang mikro terpilih dan tahap enam proses pembuatan etanol dari biomassa ganggang mikro terpilih.

3.3.1. Seleksi dan Peremajaan Ganggang Mikro

Seleksi ganggang mikro ICBB-CC air tawar bertujuan untuk mendapatkan jenis ganggang mikro dari alam untuk dikultivasi secara murni. Tahapan peremajaan diawali dengan mempersiapkan media BG 11 Hu et al. 2000 tersaji pada Tabel 8. Tabel 8. Komposisi media BG 11 Media BG 11 Komposisi gL NaNO 3 p.a 1.5 K 2 HPO 4 p.a 0.04 MgSO 4 .7H 2 O p.a 0.02 CaCl 2 .2H 2 O p.a 0.036 Citric Acid p.a 0.006 Fe ammonium Citrate 0.006 EDTA p.a 0.001 Na 2 CO 3 p.a 0.075 Trace Metal 1 ml Komposisi Trace Metal H 3 BO 3 2.86 MnCl 2 .4H 2 O 1.81 ZnSO 4 .7H 2 O 0.222 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0.079 CuSO 4 .5H 2 O 0.39 Karakterisasi etanol Confidential 41 CoNO 3 2 .6H 2 O 0.049 Sebanyak 2 ml isolat ganggang mikro diinokulasikan ke dalam 50 ml media BG11 dalam botol bening berukuran ± 100 ml. Selanjutnya dilakukan proses inkubasi selama 3 minggu dengan cara digoyang shaker untuk mencegah pengendapan sel dan diberi cahaya lampu TL tube lamp 40 Watt secara terus menerus serta suhu ruangan 27-30 o C. Selama inkubasi dilakukan pengukuran kadar biomassa pertumbuhan dengan cara mengukur optik density OD menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm OD 620nm . Seleksi ganggang mikro berdasarkan kecepatan tumbuh dan kondisi pertumbuhan. Peremajaan untuk mendapatkan ganggang mikro terseleksi pada penelitian tahap 1 tersaji pada Gambar 7. Gambar 7. Penelitian tahap 1 peremajaan ganggang mikro

3.3.2. Tahapan Kultivasi

Kultivasi ganggang mikro diawali seleksi media dengan tujuan mendapatkan media yang mempunyai laju pertumbuhan terbaik. Media yang digunakan adalah BG 11, PHM dan MBM. Tahapan kultivasi ini dilakukan agar ganggang mikro terseleksi dapat tumbuh dengan baik untuk mendapatkan biomassa yang cukup untuk digunakan pada tahap uji selanjutnya. Kultur biakan ganggang mikro diberi aerasi supaya tidak terjadi pengendapan dan diberi cahaya Ganggang mikro ICBB Peremajaan ganggang mikro dalam media BG 11 Seleksi ganggang mikro Confidential 42 lampu TL 2 x 40 Watt terus menerus. Komposisi media PHM Borowitzka 1988 dan media MBM tersaji pada Tabel 9. Pertumbuhan sel untuk mendapatkan jumlah biomassa diukur berdasarkan OD optical density setiap 24 jam dengan menggunakan spektrofotometer PharmaSpec UV-1700 SHIMADZU pada panjang gelombang 660 nm Lee et al. 1998. Kultivasi dilakukan dengan memindahkan 20 kultur segar ganggang mikro ke dalam 50 ml media BG 11, PHM dan MBM. Kultivasi dilakukan pada tiga media BG 11, PHM dan MBM pada suhu ruang di bawah penyinaran lampu pada selang 500-2000 lux dengan pemberian aerasi. Produktivitas biomassa diukur berdasarkan nilai OD, selama periode pertumbuhan hingga 27 hari, yang menghasilkan nilai OD  0.5, pada panjang gelombang 620 nm. Tabel 9. Komposisi media PHM dan MBM Media PHM Komposisi mgL Media MBM Komposisi mgL KNO 3 1000 NH 4 2 SO 4 2500 K 2 HPO 4 200 K 2 HPO 4 75 MgSO 4 .7H 2 O 200 MgSO 4 7H 2 O 75 FeCl 2 .6H 2 O 0,025 CaCl 2 1000 Citric Acid - NaCl 100 C 6 H 8 FeNO 7 - C 6 H 8 FeNO 7 6 EDTA 0,019 EDTA 1 Na 2 CO 3 p.a - TSP 245 Trace Metal 1 ml Trace Metal 1 ml Komposisi trace metal Komposisi Trace Metal H 3 BO 3 0,016 H 3 BO 3 2860 MnCl 2 .4H 2 O 0,038 MnCl 2 .4H 2 O 1810 ZnSO 4 .7H 2 O 0,002 ZnSO 4 .7H 2 O 222 Na 2 MoO 4 .2H 2 O - Na 2 MoO 4 .2H 2 O 79 CuSO 4 .5H 2 O 0.006 CuSO 4 .5H 2 O 390 CoCl 2 .6H 2 O 0.006 CoNO 3 2 .6H 2 O 49

3.3.3 . Identifikasi Ganggang Mikro

Penelitian tahap 2, identifikasi dilakukan untuk mengetahui galur ganggang mikro terpilih yang digunakan selama proses penelitian Gambar 8. Identifikasi ganggang mikro yang utama didasarkan pada karakteristik morfologi umum menggunakan mikroskop perbesaran 400 x serta sifat-sifat selular seperti: sifat pigmen fotosintetik; struktur sel dan flagela yang dibentuk oleh sel-sel yang Confidential 43 bergerak. Proses identifikasi dilakukan dengan mengacu pada Bold dan Wynne 1985 dalam buku “ Introduction to The Ganggange Structure and Reproduction” dan Toshiniko Mizuno 1970 dalam buku “Halustrations of The Fresh water Plankton of Japan”. Gambar 8. Penelitian tahap 2 penentuan kurva pertumbuhan dan umur panen

3.3.4. Produktivitas dan pemanenan

Media yang menghasilkan laju tumbuh dan kandungan biomassa paling cepat yang dipilih untuk dikembangkan di kolam kanal. Pemanenan biomassa ganggang mikro dilakukan secara gravitasi dimulai dengan nilai OD ≥ 0,5 secara terus-menerus sampai OD 0,5 konsentrasi nutrien pada media pertumbuhan menurun dan hasil panen semakin menurun. Selanjutnya biomassa basah di keringkan, biomassa kering kemudian ditimbang. Prosedur pemanenan penelitian tahap 3 disajikan pada Gambar 9. Pemanenan Ganggang mikro terpilih Dikeringkan Kultivasi pada media terpilih Pengukuran pertumbuhan sel OD Identifikasi ganggang mikro Kultivasi ganggang mikro terpilih Penentuan kurva pertumbuhan Filtrasi Biomassa basah Confidential 44 Gambar 9. Penelitian tahap 3 prosedur pemanenan dan pengeringan Untuk produktivitas biomassa ganggang mikro terseleksi, dikembangkan di kolam kanal dengan media MBM kombinasi . Modifikasi pupuk dilakukan karena TSP merupakan sumber fosfat yang murah dan mudah didapatkan. Kultivasi ganggang mikro pada media MBM kombinasi di kolam kanal dengan volume 150 L untuk produksi biomassa yang lebih banyak setelah terpilih media terbaik pada skala labroratoium. Produksi biomassa ganggang mikro terpilih pada media terpilh di kolam kanal tersaji pada Gambar 10. Pada tahap produksi dan pemanenan biomassa ganggang mikro di skala lapang, dilakukan secara terus menerus pada interval 3 - 5 hari. Laju pertumbuhan ganggang mikro direpresentasikan oleh nilai kerapatan optik OD minimum yang mencapai 0.5. Penentuan penambahan volume untuk setiap isolat berdasarkan persamaan linier dari kurva laju pertumbuhan ganggang mikro Kabinawa dan Miyamoto 1988. Pemanenan ganggang mikro dengan metode filtrasi Uduman et al. 2010 menggunakan metode pemanenan TFT tangensial flow filtrasi dengan pori-pori membran berkisar 0.45 μm. Pengeringan biomassa basah ganggang mikro secara alami. Biomassa kering Ganggang mikro terpilih Biomassa basah Pemanenan pada fase pertumbuhan dan metode pemanenan terbaik Kultivasi ganggang mikro terpilih pada media terpilih di kolam kanal Confidential 45 Gambar 10. Penelitian tahap 4 produksi biomassa ganggang mikro Setelah diperoleh biomassa ganggang mikro dalam kolam kanal, maka biomassa dikeringkan untuk dilakukan analisis proksimat. Analisis proksimat dilakukan sesuai dengan prosedur standar dalam AOAC 2005 meliputi kadar air dengan oven gravimetri, abu dengan tanur gravimetri, N-Total dan protein ditentukan dengan metoda Kjedahl titrimetri, karbohidrat dengan metoda Phenol Sulfat spektrofotometri, lemak dengan metoda Soxhlet.dan total gula dengan metode Luff Schrool titrimetri. Hasil analisis karbohidrat biomassa ganggang terpilih dilanjutkan ke penelitian tahap 5, yaitu proses pembuatan etanol pada Gambar 11. Pengeringan Biomassa basah Analisis Kadar Air Analisis Karbohidrat Analisis Kadar Abu Analisis Kadar protein Analisis kadar lemak Gambar 11. Penelitian tahap 5 proses pembuatan etanol dari karbohidrat biomassa ganggang mikro terpilih Analisis karbohidrat biomassa ganggang mikro terpilih Hidrolisis enzim Glukosa monomer Fermentasi Etanol Confidential 46

3.3.5. Hidrolisis enzim ganggang mikro terpilih Choi et al 2011

Tahap hidrolisis enzim dilakukan dengan mnggunakan biomassa ganggang mikro yang telah dikeringkan. Pada tahap hidrolisis terdiri dari 2 tahap, yaitu: 1 Likuifikasi : pada proses ini dilakukan dengan menambahkan enzim α amilase termamyl pada pH 6 dan suhu 95 o C ke dalam 5g bubuk ganggang mikro yang berukuran 35 mesh, sesuai dengan perlakuan yang digunakan dan 2 Sakarafikasi : pada proses ini dilakukan dengan menambahkan enzim amiloglukosidase AMG Selanjutnya diatur pH dan Suhu sesuai perlakuan pH 4,5 dan suhu 60 o C, kemudian dimasukkan ke dalam waterbath shaker selama 48 jam dengan suhu 60 o C pada 120 rpm.

3.3.6. Fermentasi

Dalam proses ini yeast kultur yang digunakan adalah S. cerevisiae. Gula pereduksi yang dihasilkan di pre-treatment asam dan enzim. Berdasarkan hasil terbaik pada penelitian tahap ke lima. Selanjutnya dilakukan fermentasi setelah itu dilakukan pengukuran kadar etanol menggunakan gas chromatography GC.

3.3.6.1 . Kultur S. Cerevisiae

Isolat S. cerevisiae diremajakan pada media PDA dan diinkubasi selama dua hari. Setelah itu isolat ditumbuhkan lagi pada 50 ml media YMGP yang terdiri dari ekstrak yeast 5 gl, malt 5 gl, glukosa 10 gl dan pepton 5 gl di dalam erlenmeyer 200 ml. Inkubasi dilakukan pada shaker berkecepatan 125 rpm dengan suhu 30 °C selama 24 jam.

3.3.7. Prosedur Pengujian

3.3.7.1. Analisis biokimia ganggang mikro

Analisis biokimia ganggang mikro terdiri dari : Analisis kadar lemak AOAC 2007 Sampel sebanyak 0,5 gram ditimbang dan dibungkus dengan kertas saring dan diletakkan pada alat ekstraksi soxhlet yang dipasang di atas kondensor serta labu lemak di bawahnya. Pelarut heksana dituangkan ke dalam labu lemak secukupnya sesuai dengan ukuran soxhlet yang digunakan dan dilakukan refluks Confidential 47 selama minimal 16 jam sampai pelarut turun kembali ke dalam labu lemak. Pelarut di dalam labu lemak didestilasi dan ditampung. Labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 105 o C selama lima jam. Labu lemak kemudian didinginkan dalam desikator selama 20-30 menit dan ditimbang. Kadar lemak dapat dihitung berdasarkan rumus: Analisis N-Total dan Protein Penetapan N-total pada ganggang mikro dilakukan dengan menggunakan metode Kjeldahl Apriantono et al. 1989. Serbuk ganggang mikro kering 0,5 gram dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 25 ml, lalu ditambahkan 1,9 gram campuran Se, CuSO 4 dan Na 2 SO 4 . Larutan 5 ml H 2 SO 4 pekat ditambahkan ke dalam labu, digoyangkan perlahan-lahan, kemudian lima tetes paraffin cair ditambahkan dan dipanasi, sambil digoyang perlahan-lahan, kemudian perlahan- lahan api diperbesar hingga diperoleh cairan berwarna terang hijau biru, panasi 15 menit lalu didinginkan. Kemudian aquades ditambahkan kira-kira sebanyak 50 ml, lalu isi labu dipindahkan ke dalam labu destilasi dan ditambahkan 5 ml NaOH 50. Destilat dititrasi dengan HCl 0,0999 N hingga terjadi perubahan warna dari hijau ke merah muda. Penetapan blanko juga dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas namun tanpa sampel. Kadar protein dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut : Analisis kadar air AOAC 2007 Lemak = Berat lemak g Berat sampel g Berat lemak = berat labu + lemak-berat labu X 100 Nitrogen = VHCL x NHCL x BMN x 14.007 x fp Bobot sampel g Protein = N x Faktor konversi Faktor konversi = 6,25 X 100 Confidential 48 Cawan kosong yang akan digunakan dikeringkan terlebih dahulu pada suhu 105-110 o C selama 15 menit atau sampai berat konstan, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang. Sampel kira-kira sebanyak 2 gram ditimbang dan diletakkan dalam cawan kemudian dipanaskan dalam oven selama 3-4 jam pada suhu 105-110 o C. Cawan kemudian didinginkan dalam desikator dan setelah dingin ditimbang kembali. Persentase kadar air berat basah dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Keterangan: B = Berat sampel gram B1 = Berat sampel + cawan sebelum dikeringkan B2 = Berat sampel + cawan setelah dikeringkan Analisis kadar abu AOAC 2007 Preparasi sampel biomassa ganggang mikro untuk zat mineral adalah dengan menghilangkan seluruh bahan asing dari sampel, terutama tanah yang melekat atau pasir, namun untuk mencegah terjadinya pelepasan, maka tidak mencuci sampel secara berlebihan. Sampel segera dikeringkan untuk mencegah dekomposisi atau kehilangan berat. Sampel sebanyak dua gram ditempatkan dalam wadah porselin kemudian dimasukkan dalam oven dengan suhu 60-105 o C selama delapan jam. Kemudian sampel yang sudah kering dibakar menggunakan hotplate sampai tidak berasap selama ± 20 menit. Kemudian diabukan dalam tanur bersuhu 600 o C selama tiga jam lalu ditimbang. Kadar abu dapat dihitung dengan rumus berikut: Kadar air = B B2 – B1 X 100 Kadar Abu = bobot cawan + bobot sampel sebelum dioven - bobot cawan + bobot sampel setelah dioven gram bobot sampel awal gram x 100 Confidential 49 Analisis kadar karbohidrat Analisis karbohidrat dilakukan secara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100 dengan kadar air, kadar abu, kadar protein dan kadar lemak, sehingga kadar karbohidrat tergantung pada faktor pengurangannya. Hal ini karena karbohidrat sangat berpengaruh terhadap zat gizi lainnya. Analisis karbohidrat dapat dihitung dengan menggunakan rumus: Total gula metode Phenol H 2 SO 4 Dubois et al. 1956 atau HPLC Sebelum melakukan pengujian sampel maka perlu diketahui kurva standar fenol yang digunakan. Pembuatan kurva standar fenol adalah sebagai berikut : 2 ml larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40 dan 60 μg glukosa masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml larutan fenol 5 dan dikocok. Selanjutnya 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan dengan cepat. Biarkan selama 10 menit, kocok lalu tempatkan dalam penanggas air selama 15 menit. Absorbansinya diukur pada 490 nm. Pengujian sampel sama dengan pembuatan kurva standar fenol, hanya 2 ml larutan glukosa diganti dengan 2 ml sampel. Total gula pereduksi metode DNS Miller, 1959 Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi asam 3,5–dinitrolisilat DNS membentuk senyawa yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm.  Penyiapan Pereaksi DNS Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 10,6 g asam 3,5 dinitrolisilat dan 19,8 NaOH ke dalam 1416 ml air. Setelah itu ditambahkan 306 g Na-K Tatrat, 7,6 g fenol yang dicairkan pada suhu 50 o C dan 8,3 g Na- Metabisulfit. Larutan ini diaduk rata, kemudian 3 ml larutan ini dititrasi dengan HCl 0,1 N dengan indikator fenolftalein. Banyaknya titran berkisar Kadar karbohidrat = 100 - kadar air + kadar abu + kadar lemak + kadar protein Confidential 50 5 – 6 ml. Jika kurang dari itu harus ditambahkan 2 g NaOH untuk setiap ml kekurangan HCl 0,1 N.  Penentuan Kurva Standar Kurva standar dibuat dengan mengukur mengetahui nilai gula pereduksi pada glukosa pada selang 0,2 – 0,5 mgl. Kemudian nilai gula pereduksi dicari dengan metode DNS. Hasil yang didapatkan diplotkan dalam grafik secaara linear.  Penetapan Total Gula Pereduksi Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai berikut : 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Larutan tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 5 menit. Biarkan sampai dingin pada suhu ruang. Ukur absorbansi pada panjang gelombang 550 nm. Kadar Etanol vv Setelah proses farmentasi dilanjutkan dengan proses pengujian menggunakan kromatografi gas GC. Kromatografi gas merupakan metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan senyawa organik yang mudah menguap. Kelebihan kromatografi gas, diantaranya dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi. Gas dan uap mempunyai viskositas yang rendah, demikian juga kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat, sehingga analisis relatif cepat dan sensitifitasnya tinggi. lembam seperti helium, nitrogen, argon bahkan hidrogen digerakkan dengan tekanan melalui pipa yang berisi fase diam. Perhitungan Rendemen etanol ww Rendemen etanol =

3.3.7.2. Isolasi DNA

Confidential 51 Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan metode CTAB Cetil Trimetil Amonium Bromida menurut Doyle dan Doyle 1990 yang dimodifikasi oleh Manoj et al. 2007. Sebanyak 0,1g biomassa ganggang mikro ditambahkan nitrogen cair kemudian digerus dalam mortar sampai menjadi serbuk lalu dimasukkan kedalam tabung ependorf yang berisi 600 µl campuran buffer ekstrak [2 bv CTAB, 0,02M EDTA, 1M Tris HCl pH 8, 1,4 M NaC dan 2 PolyVinil Pyrllidon]. Ekstrak diinkubasi pada suhu 65 o C selama 30 menit. Pemurnian dilakukan di dalam campuran larutan kloroform dan isoamil alkohol CIAA dengan perbandingan 24 : 1 sebanyak satu kali volume ekstrak. Suspensi dibolak-baliksecara perlahan. Suspensi disentrifiugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh ditambahkan dengan satu kali volume campuran larutan PCI Phenol : Khloroform : Isoamil alkohol dengan perbandingan 25 : 24 : 1 lalu dibolak-balik. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 o C selama 20 menit. Supernatan diendapkan dengan sodium asetat 2 M pH 5,2 sebanyak 0,1 kali volume dan etanol absolut sebanyak dua kali volume kemudian disentrifugasi 10.000 rpm pada suhu kemudian dikeringkan dengan vakum, lalu disuspensikan dengan 50 µl aquabidest. Selanjutnya ditambahkan 0,1 kali RNAse 10mgml,diinkubasi semalam pada suhu 37 o C dan dipanaskan pada suhu 70 o C selama 30 detik. Kuantitas DNA total dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer, absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Keutuhan DNA total dianalisis secara kualitatif menggunakan metode elektroforesis, dengan memigrasikan DNA pada gel agarosa 1 bv di dalmbuffer TAE IX. Confidential 52

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Eksplorasi dan Seleksi Ganggang Mikro

Persyaratan ganggang mikro yang berpotensi sebagai etanol selain kandungan karbohidrat yang tinggi adalah karakteristik pertumbuhannya yang menentukan jumlah dan lamanya pemanenan. Karakteristik pertumbuhan ganggang mikro yang diamati pertumbuhan relatif dan waktu mencapai puncak populasi. 15 isolat anggang mikro air tawar Tabel 7 koleksi Indonesian Center for Biotechnology and Biodiversity Culture Collection of Microorganisms ICBB- CC dari beberapa perairan tawar yang digunakan dalam penelitian ini. Tabel 10. Sumber Isolat ganggang mikro koleksi ICBB-CC Kode Isolat Sumber Isolat 155 Pekunden Kuto Winangun, Kebumen Confidential 53 160 Batas Purworejo - Jogyakarta 183 Pakis, Delanggu - Klaten 195 Sitokaton, Siwali, Gondangrejo - Karanganyar 205 227 Ngadul, Sumbu Lawang – Sragen Mayahan,Tawangharjo 238 Bledug Kuwu - Grobogan 248 Bledug Kuwu - Grobogan 9111 Gunung Salak- Bogor 9112 Singa Jaya – Indramayu PLB 6354 Kecamatan Garung, Kabupaten Wonosobo 9114 Telaga Warna – Puncak 293 Banyudono, Kaliori – Rembang 346 Pargan, Kedung Haur - Indramayu Sumber : ICBB-CC Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan selama 21 hari pada proses kultur puncak pertumbuhan fase eksponensial rata-rata pada hari ke 14 dengan media BG 11 diperoleh perkembangan pertumbuhan 15 isolat ganggang mikro, seperti terlihat pada Gambar 12. Confidential